Generowanie stabilnych transgenicznych *C. elegans* metodą mikrowstrzykiwania

C. elegans to niezwykle użyteczny organizm modelowy, zarówno ze względu na naszą wiedzę o jego liniach komórkowych, jak i bogactwo informacji uzyskanych dzięki zsekwencjonowaniu i przeanalizowaniu jego całego genomu. W tym filmie prezentujemy proces mikroiniekcji plazmidów do C. elegans oraz selekcję transgenicznego potomstwa za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej; jako przezroczyste zwierzę wielokomórkowe, C. elegans jest idealny do wizualizacji transgenów wykazujących ekspresję białek znakowanych fluorescencyjnie in vivo. Cześć, nazywam się Laura Berkowitz i jestem adiunktem w laboratorium Caldwell w Katedrze Nauk Biologicznych tutaj, na Uniwersytecie Alabamy.

Jestem Adam Knight, również z laboratorium Calwella na Uniwersytecie Alabama. Dzisiaj pokażę Państwu, jak przygotować się do mikroiniekcji plazmidów i jak ją przeprowadzić w celu wytworzenia transgenicznych *C. elegans*, a także wyjaśnię, jak selekcjonować i utrzymywać linie transgeniczne *C. elegans*. Zatem zacznijmy.

Zanim przystąpimy do mikrolinkcji, należy wykonać kilka kroków przygotowawczych, które teraz zaprezentuję. Najpierw przygotuj plazmidowe DNA do wstrzyknięcia; wymagane są dwa plazmidy: jeden kodujący tkankowo specyficzną ekspresję genu, który nas interesuje, oraz drugi zapewniający selekcyjny marker transformacji. Wymieszaj plazmidy w stosunku jeden do jednego, stosując stężenie 50 nanogramów per mikrolitr.

Następnie należy przygotować podkładki do wiercenia, które posłużą do unieruchomienia nicieni podczas iniekcji. Aby przygotować podkładki, najpierw należy rozłożyć na blacie kilka szkiełek nakrywkowych o wymiarach 22 na 50 mm. Za pomocą pipety Pasteura nanieście kroplę roztopionego 2% agros na jedno szkiełko nakrywkowe, a następnie bezzwłocznie nałóżcie drugie szkiełko na kroplę pod kątem 90 stopni względem pierwszego.

Pozostaw aerogel do zestalenia przez kilka sekund, a następnie usuń górną szkiełko przykrywowe. Średnica spłaszczonego dysku aerogelu powinna wynosić od 15 do 20 milimetrów. Pozostaw wkładik do całkowitego wyschnięcia na powietrzu przez kilka godzin lub przez noc.

Po wyschnięciu przechowywać podłoża w pudełku na szkiełka nakrywki w temperaturze pokojowej. Następnie przygotować kapilary do roztworu DNA. W tym celu należy wziąć kapilarę o pojemności 100 µL, rozgrzać ją w środku w płomieniu palnika i szybko rozciągnąć do około dwukrotności jej długości.

Po ostygnięciu rurki kapilarnej przełam ją na dwie połówki. Przygotuj zapas od 10 do 20 załadowanych igieł do iniekcji. Można je przechowywać pionowo w probówce do mikrowirówki.

Brack, uważaj. Końcówki ładowarki igieł są bardzo ostre. Teraz przygotuj igły do mikroiniekcji.

Igły te są wykonane ze specjalnej rurki kapilarnej zawierającej wewnętrzny szklany włókno. Włókno to pełni funkcję knota dla roztworu DNA. Do wytwarzania igieł używamy urządzenia Niki PP eight 30 Polar z ustawieniem temperatury na 24,8; w celu późniejszego przechowywania wyciąga się po kilka igieł jednocześnie.

Wiele igieł można zamontować na pasku plasteliny modelarskiej. Do rozbicia końcówki wyciągniętej igły zostaną użyte małe odłamki szkiełka nakrywkowego. Odłamki te przygotowuje się, owijając szkiełko nakrywkowe o wymiarach 18 na 18 milimetrów chusteczką Kimwipe i delikatnie wywierając nacisk, aż do momentu rozbicia go na kilka części.

Należy użyć odłamków o rozmiarze około trzech na cztery milimetry. Oprócz przygotowania DNA i igieł, należy przygotować od 50 do 100 odpowiednio rozwiniętych osobników. Dla każdego konstruktu wektora ekspresyjnego przeznaczonego do wstrzyknięcia należy przygotować dwa nicienie typu dzikiego.

Jesteśmy teraz gotowi do przygotowania mikromanipulatora do mikroiniekcji. Aby rozpocząć konfigurację mikroskopu, otwórz główny zawór w zbiorniku z helem, który jest podłączony do ramienia i uchwytu igły do mikroiniekcji. Zamknij regulator, aby umożliwić dopływ gazu do przewodu.

Po ustawieniu ciśnienia na 35 PSI gaz można uwolnić za pomocą pedału nożnego. Następnie należy wprowadzić ładowarkę igłową do standardowej rurki pipety grawitacyjnej i nanieść niewielką ilość mieszaniny plazmidów, około 1 µL. Teraz należy delikatnie wsunąć ładowarkę przez całą igłę do mikroiniekcji, aż do momentu wyczucia oporu.

Wypchnij roztwór DNA, delikatnie wydmuchując go, a następnie wyjmij ładowarkę. Po załadowaniu DNA wprowadź igłę do ramienia mikroiniekcyjnego, uważając, aby umieścić ją wewnątrz małej wewnętrznej uszczelki gumowej, a następnie przymocuj ją do ramienia manipulatora. Następnie umieść odłamek szkła kryształowego służący do łamania igieł na krawędzi podkładki pod świdrem.

Pokryć odłamek oraz całą powierzchnię podkładki pod świdrem olejkiem węglowym. Następnie umieścić podkładkę na stoliku mikroskopu odwróconego. Po umieszczeniu podkładki, ustawić igłę w centrum pola widzenia, korzystając z obiektywu Forex i oświetlenia w polu jasnym, jednak nie zanurzać jej jeszcze w oleju.

Następnie ustaw wewnętrzną krawędź odłamka szkiełka nakrywek w centrum i ustaw ostrość. Obniż igłę do oleju, doprowadzając ją do tej samej płaszczyzny ogniskowania co odłamek szkiełka nakrywek. Zwiększ powiększenie, przełączając na obiektyw 40 x, a następnie ponownie ustaw ostrość na krawędzi odłamka i w razie potrzeby skoryguj pozycję końcówki igły.

Teraz należy przełamać końcówkę igły wstrzykującej. Delikatnie dociśnij igłę do krawędzi odłamka szkiełka nakrywkowego, jednocześnie podając krótki impuls gazu za pomocą pedału. Igła zostanie w ten sposób odpowiednio przełamana.

Niepożądany jest nadmierny przepływ cieczy, prowadzący do wypływania małych kropel z końcówki igły z powodu zbyt dużego otworu, ponieważ może to doprowadzić do śmierci zwierząt. Po przygotowaniu igły rozpoczynamy mikrowstrzykiwanie. Następnie należy usunąć podkładkę pod świder ze stolika, unosząc igłę do góry.

Nie należy jednak zmieniać położenia osi X lub Y. Wysuń stolik spod igły. Zdejmij podkładkę z świdrem i umieść ją pod mikroskopem stereoskopowym.

Przenieś dżdżownicę na podkładkę pod powierzchnię oleju. Jeśli dżdżownica się wierci, delikatnie przesuwaj ją, aż zetknie się z podkładką świdrową; wilgotna dżdżownica powinna przywrzeć do suchego podłoża. Szybko umieść podkładkę świdrową z powrotem na stoliku, centrując dżdżownicę w polu widzenia.

Następnie opuść igłę do tej samej płaszczyzny ogniskowania co niczeń. Przełącz filtry w mikroskopie odwróconym na oświetlenie Hoffmana. Ten filtr kontrastowy pozwala na uwidocznienie szczegółów morfologicznych nicienia.

Używając obiektywu 40x, ustaw ostrość na ziarniste centrum sensoryczne gonady robaka, znajdujące się poniżej plastra miodu jąder zarodkowych. Wybierz gonadę położoną po stronie robaka zwróconej w stronę igły. Precyzyjnie dostrój pozycję igły, aż jej końcówka również będzie w polu ostrości.

Ostrożnie wprowadź igłę do centrum gonady i przyłóż krótki impuls ciśnienia gazu, aby wprowadzić jedną lub dwie krople DNA do ramienia gonady. Przy odpowiedniej wprawie i umiejętności powinna być widoczna fala cieczy rozprzestrzeniająca się w obrębie dystalnej części gonady. Można w ten sposób za każdym razem precyzyjnie trafić w środek gonady.

Należy pamiętać, że podczas wstrzykiwania dżdżownicy ważne jest szybkie tempo pracy, ponieważ zwierzę może łatwo ulec wysuszeniu. Cały proces powinien idealnie zająć mniej niż jedną do dwóch minut.

Po zakończeniu wtryskiwania należy zdjąć podkładkę z wiertłem ze stołu i umieścić ją pod mikroskopem sekcyjnym. Nanieś 1 µL buforu M9 bezpośrednio na wstrzykniętego nicienia. Może to wymagać zanurzenia końcówki pipety poniżej powierzchni oleju halocarbon.

Bufor powinien nawodnić nicienia, który następnie oddzieli się od powierzchni podkładki aeros, po czym należy przenieść nicienia na zwykłą płytkę za pomocą zgłębnika do nicieni. Teraz przekażę wstrzyknięte nicienie Adamowi, który zaprezentuje nam proces selekcji i utrzymania linii transgenicznych. Wstrzyknięte nicienie przenosi się na poszczególne, świeżo zasiałe płytki o średnicy 60 mm i pozostawia do rozmnożenia.

Robaki te reprezentują generację P zero. Zazwyczaj zainfekowane zwierzęta inkubuje się w temperaturze 20 °C przez dwa do trzech dni, aż do pojawienia się potomstwa. Po pojawieniu się potomstwa można rozpocząć przesiewy w celu wyselekcjonowania robaków transgenicznych.

Potomstwo F1 jest obserwowane pod kątem obecności markera transgenicznego. W tym przypadku marker selekcyjny jest fluorescencyjny, co pozwala na przesiewanie za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego. Każde fluorescencyjne zwierzę F1 będące nosicielem jest osobno klonowane na nowej płytce.

Wstrzyknięte P0 może wyprodukować od jednego do pięciu fluorescencyjnych potomków spośród wszystkich osobników F1. Pozostawia się hermafrodytów F1 do rozmnażania w temperaturze 20 °C przez dwa do trzech dni, aż pojawi się potomstwo. Gdy generacja F2 będzie gotowa, poddaje się ją również obserwacji pod kątem obecności zwierząt transgenicznych. Zwierzęta F2, które odziedziczyły i wyraziły marker transgeniczny, są uznawane za linię stabilną.

Każdą niezależną linię stabilną należy prowadzić jako oddzielną linię nicieni, propagując każdą z nich poprzez przenoszenie kilku zwierząt transgenicznych na nową płytkę w każdym pokoleniu. Operację tę należy przeprowadzić przy użyciu fluorescencyjnego stereomikroskopu. Jeśli marker selekcyjny jest fluorescencyjny, w celu skontrolowania zmienności liczby kopii genu należy wygenerować minimum trzy niezależne linie stabilne dla każdego wstrzykniętego konstruktu.

Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak mikroiniekować konstrukcje wektorów ekspresyjnych, obserwować ich ekspresję oraz selekcjonować stabilne linie komórkowe. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.