Zastosowanie testu degeneracji neuronów dopaminergicznych u C. elegans w celu walidacji potencjalnych genów choroby Parkinsona

W laboratorium Caldwella, znanym również jako „Worm Shack”, badamy mechanizmy chorób neurologicznych u *C. elegans*. Po długim dniu owocnych eksperymentów nagradzamy się aktywnością rekreacyjną. Cześć, nazywam się Adam Knight i jestem studentem studiów licencjackich w laboratorium Caldwella na Wydziale Nauk Biologicznych Uniwersytetu Alabamy.

Dzisiaj wraz z zespołem pokażemy, jak przeprowadzić test degeneracji neuronów dopaminergicznych u C. elegans. Skrzyżuję szczep nicieni z neurodegeneracją neuronów dopaminergicznych ze szczepami transgenicznymi, które nadmiernie ekspresyjne potencjalne geny związane z chorobą w neuronach dopaminergicznych. Cześć, nazywam się Adam Harrington i jestem doktorantem w laboratorium Caldwella.

Dzisiaj pokażę Państwu, jak przygotować transgeniczne nicienie do analizy neuronów dopaminergicznych. Witajcie, nazywam się Shu Amichi i jestem studentem studiów doktoranckich. Przedstawię tutaj sposób badania neuronów dopaminergicznych C. elegans, zwanych CEP i ADE.

Zazwyczaj nicienie wykazujące ekspresję wyłącznie GFP w neuronach dopaminergicznych nie przejawiają śmierci komórkowej. Jednak w obecności CLE zaobserwują Państwo zjawisko to oraz zależną od wieku neurodegenerację. Wykorzystując ten test, w neuronach dopaminergicznych można koekspresować transgen, aby określić, czy jest on w stanie nasilać lub hamować toksyczność indukowaną przez CLE. Przejdźmy zatem do części praktycznej.

Przed przeprowadzeniem analizy neuronów dopaminergicznych należy najpierw skrzyżować odpowiednie szczepy GaN, aby rozpocząć proces; na płytkę do kopulacji należy nanieść osiem samców wykazujących ekspresję zarówno alphas nucle, jak i GFP pod kontrolą promotora specyficznego dla neuronów dopaminergicznych dat one. Następnie należy dodać dwie transgeniczne osobniki C. elegans w stadium L4, które wykazują specyficzną dla neuronów dopaminergicznych ekspresję badanego genu kandydata, a także ekspresję fluorescencyjnego markera selekcyjnego DS red two w komórkach mięśni ściany ciała. Należy zaznaczyć, że dla każdej konstrukcji transgenu generujemy trzy stabilne linie transgeniczne.

W związku z tym to krzyżowanie genetyczne powinno zostać przeprowadzone oddzielnie dla każdej z trzech stworzonych stabilnych linii. Po dwóch dniach usunąć i zutylizować samce po dodatkowych dwóch do trzech dniach. Przebadać pokolenie F1.

Uzyskano kilka potomstwo męskie, co oznacza, że kopulacja zakończyła się sukcesem. Następnie przenieś indywidualnie na nowe płytki po pięć zwierząt z linii Aphrodite L4 z każdego krzyżowania, które wykazują zarówno marker fluorescencyjny GFP odziedziczony po rodzicu męskim, jak i fluorescencyjny marker ścian mięśni ciała DS red 2 odziedziczony po rodzicu hamadi. Przeniesione zwierzęta muszą znajdować się w stadium L4, aby upewnić się, że nie doszło jeszcze do kopulacji.

Pozostawiając samce na płytce, należy pozwolić zwierzętom na samozapłodnienie przez trzy do czterech dni w celu uzyskania potomstwa F2. Następnie należy wyselekcjonować potomstwo F2; w tym celu przenieś od pięciu do 10 zwierząt wykazujących oba markery centromeryczne na oddzielne, indywidualne płytki.

Następnie należy przeprowadzić przesiewową analizę pokolenia F3 w celu wyłonienia szalek, w których sto procent zwierząt wykazuje ekspresję GFP w neuronach dopaminergicznych, a część z nich wykazuje ekspresję fluorescencyjnego markera DS red two w komórkach mięśni ściany ciała. Zwierzęta te będą homozygotami pod względem genów alfa synukleiny i GFP, a także będą stabilnie transmitować nowo stworzony transgen. Po zakończeniu przesiewu można przystąpić do analizy neuronów dopaminergicznych.

Aby rozpocząć analizę neuronów, przygotuj świeże płytki z trzema zwierzętami F3 zidentyfikowanymi w poprzednim kroku. Przygotuj płytkę dla każdej z trzech linii transgenicznych. Dodatkowo wysiej szczep z samą α-synukleiną GFP jako kontrolę i pozwól nicieniom urosnąć do stadium dorosłego.

Gdy nicienie osiągną wiek dorosły, przenieś od 30 do 40 zwierząt transgenicznych z każdej linii na nową płytkę. Pozostaw je na pięć godzin w temperaturze 20 °C w celu zniesienia jaj. Po pięciu godzinach usuń i zutylizuj zwierzęta.

Zarodki rozwijają się w obecności osobników dorosłych przez trzy do czterech dni w temperaturze 20 °C, aż osiągną stadium L4. Następnie przenosi się około stu transgenicznych zwierząt w stadium L4 na płytkę zawierającą 0,04 mg/mL 5-fluorodeoksyurydyny.

Ten analog nukleotydu zapobiega rozwojowi następnego pokolenia poprzez hamowanie syntezy DNA. Ponieważ płytki z FDUR są światłoczułe, należy chronić je przed światłem, trzymając je pod przykryciem i całkowicie owinięte. Przygotuj podkład z agarozu do analizy nicieni.

Należy używać ich na świeżo i nie dopuszczać do ich wyschnięcia. Przygotuj dwa szkiełka przedmiotowe, na których wzdłuż naklejono kawałek taśmy. Taśma służy jako ogranicznik zapewniający równą grubość warstw.

Połóż trzecie szkiełko pomiędzy nimi na blacie. Są ustawione. Trzy obok siebie.

Nanieś kroplę roztopionego agaru na środkową część szkiełka i szybko połóż na niej kolejne szkiełko prostopadle do dwóch pierwszych, obejmując wszystkie trzy szkiełka. Powtórz czynność, aby przygotować kilka dodatkowych pól agarowych, zgodnie z liczbą próbek przeznaczonych do analizy. Po przygotowaniu pól agarowych nanieś kroplę 6 µL 3 mM anestetyka na szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 × 30 mm.

Przenieś 40 dorosłych zwierząt do kropli, a następnie odwróć szkiełko nakrywkowe na podkładkę agarową. Powtórz czynność dla każdej z pozostałych linii. Oceń obecność każdego neuronu CEP oraz neuronu D u 30 zwierząt z każdej linii.

Używając mikroskopu złożonego z epifluorescencją i kostką filtrującą umożliwiającą wizualizację FITC lub GFP, wykorzystamy kostkę filtrującą endo G-F-P-H-Y-Q do zapisywania danych w arkuszu oceny. Zwierzęta typu dzikiego zachowują pełną ekspresję GFP w czterech neuronach CEP i dwóch neuronach A DE. Pojedyncze zwierzęta wykazujące utratę neuronów D są klasyfikowane jako typ dziki lub degenerujące.

Neurony te zapisuje się jako LG lub utrata GFP. Podobnie stopień degeneracji można ocenić, licząc całkowitą liczbę utraconych neuronów u każdego zwierzęcia, a następnie powtarzając analizę jeszcze dwukrotnie dla danej populacji. W każdym badaniu wykorzystano dodatkowo 30 zwierząt na linię.

Obliczana jest średnia całkowita liczba nicieni wykazujących neurony dopaminergiczne typu dzikiego z trzech rund analizy. Analiza statystyczna neuroprotekcji jest następnie przeprowadzana przy użyciu testu t-Studenta z wartością P mniejszą niż 0,05. Aby porównać nicienie kontrolne ze szczepami wykazującymi nadekspresję genów kandydatów w neuronach dopaminergicznych, analizę tę przeprowadza się w różne dni po ułożeniu jaj, przy czym odpowiednie dni analizy są ustalane empirycznie.

Na przykład ustaliliśmy, że odpowiednio 77%, 87% i 90% zwierząt alpha CLE plus GFP wykazuje degenerację neuronów dopaminergicznych w szóstym, siódmym i dziesiątym dniu po rozwoju. W związku z tym, jeśli przewidujemy, że badany transgen może nasilać neurodegenerację, przeprowadzimy analizę w szóstym dniu. Analogicznie, transgeny, które mogą hamować neurodegenerację, będą analizowane w siódmym i dziesiątym dniu.

Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić test neurodegeneracji dopaminergicznej u C. elegans. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o następujących kwestiach: po pierwsze, należy użyć odpowiedniego markera do selekcji podczas krzyżówek genetycznych; po drugie, do krzyżówek należy wykorzystać zdrowe samce oraz larwy w stadium L4.

Po trzecie, należy uważnie i konsekwentnie zliczać neurony CEP oraz DE. Procedura ta pozwoli na szybką analizę czynników genetycznych, które mogą nasilać lub hamować indukowaną przez alpha alpha CLE neurodegenerację. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.