Mikroskopia kontrastowa fazowa i mikroskopia kontrastowa interferencyjna (DIC)
6 sierpnia 2008
Niniejszy protokół przedstawia zasady i praktyczne zastosowania mikroskopii fazowo-kontrastowej oraz mikroskopii kontrastu interferencyjnego (DIC)
Mikroskopia świetlna jest jednym z, jeśli nie najważniejszym narzędziem w dziedzinie badań biomedycznych. W zależności od zastosowania, do obserwacji preparatów pożądane są różne tryby oświetlenia. Niniejszy film zaprezentuje dwa optyczne tryby oświetlenia przeświecającego: kontrast fazowy oraz mikroskopię DIC, czyli kontrast interferencyjny różnicowy.
Witam, nazywam się Victoria San Frolic i reprezentuję centralne laboratorium obrazowania optycznego na University of Texas Health Science Center w San Antonio. Dzisiaj pokażę Państwu, jak prawidłowo obserwować preparaty z wykorzystaniem mikroskopii fazowo-kontrastowej oraz mikroskopii kontrastu interferencyjnego (DIC). Zacznijmy zatem.
Standardowa mikroskopia w polu jasnym nie jest odpowiednia do obserwacji przezroczystych i bezbarwnych preparatów. Mikroskopia fazowo-kontrastowa jest często stosowana w celu uzyskania kontrastu w przypadku przezroczystych, nieabsorbujących światła preparatów biologicznych. Technika ta została opracowana w 1942 roku przez Zernike, który za to osiągnięcie otrzymał Nagrodę Nobla.
Mikroskop fazowo-kontrastowy to jasnopolowy mikroskop świetlny wyposażony w specjalne obiektywy do kontrastu fazowego, które zawierają płytkę lub pierścień fazowy, oraz pierścień kondensora zamiast przysłony. Pierścień ten znajduje się zazwyczaj w obrotowej głowicy kondensora, a jego rozmiar należy dobrać do poszczególnych obiektywów. Po ustawieniu oświetlenia Köhlera należy wybrać odpowiedni obiektyw fazowy, a następnie ustawić właściwy pierścień fazowy w kondensorze.
Po prawidłowym ustawieniu pierścienia fazowego obiektywu i pierścienia kondensora tak, aby były współśrodkowe i nakładały się na siebie, możemy obejrzeć preparat i odpowiednio dostroić ostrość. Zaprezentujmy zatem, jak wygląda kontrast fazowy w mikroskopie. Oto widok przekroju wątroby szczura.
Pod mikroskopem w kontraście fazowym. Metoda ta poprawia widoczność materiału biologicznego, zmieniając kontrast z różnych odcieni szarości na odcienie od czerni do bieli. Zauważą Państwo jednak, że preparaty są otoczone aureolą, która zaciera drobne struktury.
Ta aureola jest artefaktem oświetlenia przez pierścień fazowy. Teraz zauważą Państwo, że po przełączeniu na pole jasne, preparat ten jest bardzo trudny do obserwacji. Po powrocie do kontrastu fazowego możemy wyraźnie zobaczyć strukturę i kształt komórek w tkance wątroby szczura od czasu wprowadzenia tej metody pod koniec lat 60. XX wieku.
Mikroskopia kontrastowa różnicowa, znana jako DIC, zyskała popularność w badaniach biomedycznych dzięki możliwości uzyskiwania obrazów struktur o wysokiej rozdzielczości poprzez wzmacnianie kontrastu na granicach faz; otrzymany obraz stanowi bardzo cienki przekrój optyczny. W rzeczywistości zdolność DIC do tworzenia przekrojów optycznych sprawiła, że stała się ona użyteczną metodą oświetlenia światłem przechodzącym, uzupełniającą mikroskopię konfokalną. Mikroskop DIC jest mikroskopem świetlnym w polu jasnym, wzbogaconym o następujące elementy: polaryzator umieszczony pomiędzy źródłem światła a kondensorem.
Pryzmat rozdzielający wiązkę DIC w części kondensora, pryzmat łączący wiązkę DIC tuż za obiektywem oraz analizator w przestrzeni nieskończonej przed obiema soczewkami. Aby uzyskać najlepsze parametry optyki DIC, należy najpierw ustawić mikroskop świetlny zgodnie z zasadą oświetlenia Köhlera, a następnie umieścić elementy DIC w torze optycznym. Światło ze źródła przechodzi przez polaryzator, a następnie jest rozdzielane przez pierwszy pryzmat.
Te sparowane wiązki biegną blisko siebie. Jeśli obie wiązki przechodzą przez ten sam materiał w preparacie, to po ponownym połączeniu przez drugi pryzmat nie interferują ze sobą i w związku z tym wydają się szare. Jednakże na krawędzi struktury jedna z wiązek pary przechodzi przez inny materiał niż jej odpowiednik i ulega zmianie.
Kiedy wiązki te zostaną ponownie połączone przez drugi pryzmat, wystąpi interferencja konstruktywna, tworząca jasny punkt, lub destruktywna, tworząca ciemny punkt. Oto obraz okrzemek w kontraście DIC. Zauważą Państwo, że drobne szczegóły struktury okrzemek są wyraźnie widoczne.
Jeśli jednak usuniemy optykę DIC, szczegóły te znikają. Kontrast w obrębie preparatu jest jasny po jednej stronie i ciemniejszy po drugiej. Daje to wrażenie topografii, lecz w rzeczywistości jest to złudzenie.
Kierunek efektu rzucanego cienia można odwrócić, obracając polaryzator przez punkt przecięcia do przeciwnego kontrastu. Przeanalizowaliśmy właśnie tryby optyczne kontrastu fazowego i DIC. Przypominamy, że eliminacja kontrastu fazowego wzmacnia kontrast badanych obiektów, zmieniając czernie w biele, co jest przydatne do obserwacji preparatów bezbarwnych i przezroczystych.
DIC generuje również kontrast w preparacie. Odbywa się to poprzez tworzenie obrazu o wysokiej rozdzielczości cienkiego przekroju optycznego. To wszystko.
Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w pracy z mikroskopią.
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia zasady i praktyczne zastosowania mikroskopii fazowo-kontrastowej oraz mikroskopii z dyferencjalnym kontrastem interferencyjnym (DIC). Techniki te usprawniają wizualizację przezroczystych i bezbarwnych preparatów biologicznych, stanowiąc niezbędne narzędzia w badaniach biomedycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Badania biomedyczne
- Techniki mikroskopowe
- Obrazowanie optyczne
Wprowadzenie
- Mikroskopia świetlna jest kluczowa do obserwacji preparatów biologicznych.
- Mikroskopia kontrastowa zwiększa kontrast w przypadku preparatów przezroczystych.
- Mikroskopia DIC zapewnia obrazy o wysokiej rozdzielczości dla struktur drobnych.
- Obie techniki są niezbędne do skutecznej analizy preparatów.
Cel badania
- W celu zademonstrowania zastosowania mikroskopii fazokontrastowej i DIC.
- W celu wyjaśnienia konfiguracji i ustawiania technik mikroskopowych.
- W celu podkreślenia zalet tych metod w obserwacji materiałów biologicznych.
Zastosowane metody
- Ustawienie oświetlenia Köhlera dla optymalnego rozkładu światła.
- Wykorzystanie obiektywów i pierścieni fazowych.
- Zastosowanie optyki DIC, w tym polaryzatorów i pryzmatów dzielących wiązkę.
- Porównanie widoczności preparatów przy zastosowaniu różnych technik mikroskopowych.
Główne wyniki
- Mikroskopia fazowo-kontrastowa ujawnia struktury komórkowe w przezroczystych preparatach.
- Mikroskopia DIC podkreśla drobne szczegóły i zapewnia efekt topograficzny.
- Obie techniki znacząco poprawiają klarowność preparatów biologicznych.
- Zauważono i wyjaśniono występowanie artefaktów, takich jak halo w mikroskopii fazowo-kontrastowej.
Wnioski
- Kontrast fazowy jest skuteczny do obrazowania preparatów bezbarwnych i przezroczystych.
- Mikroskopia DIC oferuje obrazowanie struktur drobnych o wysokiej rozdzielczości.
- Obie metody są cenne dla rozwoju badań w naukach biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Mikroskopia fazokontrastowa i DIC umożliwiają wizualizację przezroczystych, nieabsorbujących światła preparatów biologicznych, wspierając procesy wczesnego odkrywania, w których wymagane jest obrazowanie bezznakowe. Techniki te pozwalają na ograniczenie ryzyka mechanistycznego poprzez ujawnianie szczegółów strukturalnych i morfologii funkcjonalnej w żywych komórkach i tkankach bez konieczności ich fiksacji lub barwienia. Ich integracja z potokami badawczymi zwiększa pewność walidacji celu, umożliwiając bezpośrednią obserwację odpowiedzi fenotypowych i architektury komórkowej w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia bezznaczeniową obserwację przezroczystych próbek, takich jak żywe komórki i przekroje tkanek, w celu oceny zmian morfologicznych powiązanych z modulacją celu.
- Wartość operacyjna: Wspiera szybką analizę fenotypów komórkowych bez konieczności stosowania znaczników fluorescencyjnych lub fiksacji chemicznej, co skraca czas przygotowania testu.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność co do hipotez dotyczących celu poprzez umożliwienie bezpośredniej wizualizacji fenotypów strukturalnych i funkcjonalnych w systemach istotnych dla danej choroby.
Przesiew i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Zapewnia wysokokontrastowe obrazowanie bez użycia znaczników, odpowiednie do opracowywania testów fenotypowych, w których przezroczystość maskuje szczegóły w obrazowaniu w jasnym polu.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację warunków obrazowania poprzez oświetlenie Köhlera oraz precyzyjne ustawienie płytek fazowych lub pryzmatów DIC, co poprawia powtarzalność między poszczególnymi seriami pomiarów.
- Skalowalność: Kompatybilność z formatami wielodołkowymi płytek po integracji z zautomatyzowanymi systemami mikroskopowymi, co wspiera kampanie przesiewowe o średniej przepustowości.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z fazą przedkliniczną, umożliwiając spójne obrazowanie pierwotnych komórek, eksplantatów i modeli embrionalnych w ramach różnych procesów badawczych.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Ujawnia szczegółowe detale strukturalne na stykach tkanek, co pomaga wyjaśnić mechanizmy działania w złożonych systemach biologicznych.
- Systemy istotne dla chorób: Możliwość zastosowania w grubych preparatach, w tym w skrawkach tkanek, jajach i embrionach, co wspiera ewaluację w fizjologicznie złożonych modelach.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Mikroskopia fazokontrastowa i DIC stanowią technologie umożliwiające w procesie odkryć naukowych, wspierając weryfikację hipotez w biologii podstawowej, przygotowanie testów do skriningu oraz analizę morfologiczną w badaniach translacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia weryfikację hipotez, umożliwiając bezpośrednią obserwację odpowiedzi komórkowych na zaburzenia w przezroczystych, niebarwionych preparatach.
- Przesiewanie: Wspiera rozwój analiz poprzez powtarzalne, wysokokontrastowe obrazowanie preparatów bez znakowania, co zmniejsza zmienność odczytów fenotypowych.
- Analityka: Generuje ilościowe pomiary intensywności i kontrastu na granicach struktur, umożliwiając obiektywne porównywanie warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość dzięki spójnej wizualizacji tkanek pierwotnych i eksplantów, od etapu odkryć po walidację przedkliniczną.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi możliwość ponownego wykorzystania potencjału obrazowania pomiędzy wydziałami, ograniczając dublowanie zasobów mikroskopowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez ujawnianie szczegółów strukturalnych oraz cech topologicznych w żywych, niebarwionych preparatach.
- Wartość operacyjna: sprzyja standaryzacji dzięki określonym procedurom ustawiania pierścieni fazowych i optyki DIC, co zwiększa codzienną powtarzalność wyników.
- Wartość strategiczna: usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez zwiększenie pewności w obserwacjach fenotypowych, redukując tym samym straty na późnych etapach wynikające z nieoczekiwanej złożoności biologicznej.
- Wpływ na portfolio: umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o bezpośrednie, bezetykietowe dowody fenotypowe z systemów istotnych dla danej choroby.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie wyrównywania optycznego, w tym oświetlenia Koehlera oraz precyzyjnego centrowania płytek fazowych lub pryzmatów DIC.
- Zależność od specjalistycznego sprzętu: obiektywów do kontrastu fazowego z pierścieniami fazowymi, pierścieniami kondensora, polaryzatorami, pryzmatami rozdzielającymi i łączącymi wiązkę oraz analizatorami.
- Konieczność standaryzacji protokołów oświetlenia i wyrównywania pomiędzy zespołami w celu zapewnienia spójnych wyników dla różnych użytkowników i ośrodków.
- Kwestie adaptacyjne obejmują dopasowanie współczynnika załamania światła oraz grubość preparatu, co wpływa na jakość sekcji DIC i artefakty halo w kontraście fazowym.
- Ograniczenia praktyczne obejmują artefakty halo w kontraście fazowym, które mogą przesłaniać drobne struktury, oraz efekt cienia kierunkowego w DIC, który jest złudzeniem optycznym i nie reprezentuje rzeczywistej topografii.
