Immunoprecypitacja zmetylowanego DNA

Niniejszy film przedstawia protokół immunoprecypitacji zmetylowanego DNA, znany jako MeDIP. Jest to metoda służąca do specyficznego izolowania zmetylowanego DNA w sposób nieobciążony. Metylacja DNA u ssaków charakteryzuje się przyłączeniem grupy metylowej do pozycji C5 cytozyny.

W przypadku obecności w dinukleotydzie CpG, jest to odwracalna modyfikacja epigenetyczna, która odgrywa istotną rolę w prawidłowym rozwoju, jak również w przebiegu wielu procesów chorobowych. Do prawidłowych funkcji metylacji DNA należą inaktywacja chromosomu X u samic, wyciszanie elementów powtarzalnych, imprinting genomowy oraz utrzymanie stabilności genomu. Wykazano również, że metylacja DNA odgrywa rolę w licznych chorobach, takich jak nowotwory, zespół de Willebranda, zespół Angelmana, niedobór odporności, niestabilność centromeryczna oraz zespół anomalii twarzy.

W nowotworach, na przykład, nieprawidłowa hipermetylacja promotorów może prowadzić do wyciszenia kluczowych genów supresorowych. Podczas gdy niewłaściwa hipometylacja skutkuje niestabilnością chromosomową i aktywacją onkogenów, proces ten rozpoczyna się od sonikacji DNA w celu uzyskania fragmentów o wielkości od 300 do 1000 par zasad. Następnie sonikowane DNA poddaje się denaturacji w temperaturze 95 °C.

Dodaje się przeciwciała pierwszorzędowe, które rozpoznają 5-metylocytozynę, i pozostawia się je do związania z metylowanymi fragmentami DNA. Przeciwciała drugorzędowe, sprzężone z magnetycznymi kuleczkami DynaBeads, służą do izolacji fragmentów DNA związanych przez przeciwciała pierwszorzędowe. Fragmenty niemetylowane są usuwane, a przeciwciała trawione proteinazą.

Oczyszczanie za pomocą fenolu i chloroformu usuwa strawione białka, a wytrącanie oczyszcza DNA, które jest teraz wzbogacone o fragmenty zmetylowane. Otrzymane DNA może być wykorzystane w takich zastosowaniach jak mikroarray PCR oraz sekwencjonowanie. Procedurę tę zazwyczaj przeprowadza się w ciągu dwóch dni.

Pierwszy dzień obejmuje przygotowanie DNA, immunoprecypitację po sonikacji oraz trawienie białek. Drugi dzień obejmuje ekstrakcję chloroformem w określonym pH oraz precypitację etanolem w celu oczyszczenia i wyizolowania DNA wzbogaconego pod kątem metylacji. Do przeprowadzenia procedury wymagane są niektóre specjalistyczne materiały, w tym silikonizowane probówki do wirowania, urządzenie do sonikacji DNA, przeciwciało pierwotne (monoklonalne przeciwciało mysie anty-5' metylacyjne), przeciwciało wtórne (Dynabeads sprzężone z owczym anty-ludzkim IgG) oraz magnetyczna statywa na probówki.

Pierwszym krokiem w protokole „The meetup” jest przygotowanie DNA. Niezbędne jest wcześniejsze określenie charakteru DNA. Znajomość stanu DNA w próbce, w szczególności czy jest ono głównie dwu- czy jednoniciowe, jest wymagana, ponieważ dokładne ilościowe oznaczenie próbki ma kluczowe znaczenie, a na różne metody określania ilości DNA może niekorzystnie wpływać obecność niepożądanych form DNA.

Ilość dwuniciowego DNA można łatwo ocenić za pomocą fotometrii spektralnej przy użyciu NanoDrop 3000; należy nanieść 1,5 µL i ustawić typ pomiaru na kwas nukleinowy, wybrać DNA 50 jako metodę obliczeń oraz zainicjować urządzenie za pomocą 1,5 µL wody. Oczyścić podstawki i przeprowadzić pomiar tła (blank) przy użyciu 1,5 µL cieczy. Próbka jest rozpuszczona w; oczyścić podstawki, nanieść 1,5 µL próbki i nacisnąć przycisk pomiaru.

Podane zostanie stężenie, które można wykorzystać. Aby obliczyć liczbę potrzebnych mikrolitrów, należy przyjąć stosunek A₂₆₀ do A₂₈₀ wynoszący 1,8, który jest tutaj wartością idealną. Przygotowano próbkę o masie 1 µg.

Jednakże próbka o masie zaledwie 200 nanogramów jest wystarczająca do uzyskania pomyślnych wyników. Następnie wprowadź próbkę DNA do czystej probówki silikonizowanej. Dodaj odpowiednią ilość sterylnej wody, aby uzyskać objętość końcową 50 microliters.

Sonikację DNA oraz immunoprecypitację należy przeprowadzać w probówkach silikonizowanych, aby zapobiec nieswoistemu wiązaniu DNA i białek do ścianek probówek. Po przygotowaniu DNA próbka musi zostać poddana sonikacji w celu fragmentacji DNA, ponieważ immunoprecypitacja jest bardziej efektywna przy mniejszych fragmentach DNA. Należy umieścić próbkę w sonikatorze, upewniając się, że ustawienie mocy jest wysokie, a czas działania urządzenia wynosi 30 sekund. Po zakończeniu 30-sekundowego cyklu należy wypełnić podstawę wodą o temperaturze 4 °C do linii wypełnienia.

Sonicuj próbkę przez siedem minut. Po zakończeniu sonikacji wyjmij probówkę i umieść ją w lodzie. Ważne jest, aby wcześniej zoptymalizować warunki sonikacji dla przewidywanego rodzaju próbki oraz wielkości DNA.

Na przykład częściowo zdegradowana próbka DNA będzie wymagała krótszego czasu sonikacji. Produkty sonikacji można zwizualizować za pomocą standardowych technik elektroforetycznych. Na tym etapie pożądane są fragmenty DNA o długości od 300 do 1000 par zasad do późniejszego zastosowania.

W testach macierzyjowych i PCR należy zachować jedną piątą DNA jako DNA wejściowe lub referencyjne; w tym przypadku 800 nanogramów sonikowanego DNA zostanie użytych do immunoprecypitacji, a reszta zostanie odłożona jako DNA referencyjne. Kolejnym krokiem w protokole ośrodka jest immunoprecypitacja lub reakcja IP; przed dodaniem przeciwciała pierwszorzędowego DNA musi zostać zdenaturowane. Denaturacja jest konieczna, ponieważ przeciwciało pierwszorzędowe jest wrażliwe na jednoniciowe DNA.

Umieść próbkę w kąpieli wodnej w temperaturze 95°C przez 10 minut. Po zakończeniu etapu denaturacji natychmiast przenieś probówkę na lód na co najmniej pięć minut. Zapobiegnie to ponownemu hybrydyzowaniu zdenaturowanego DNA i zapewni optymalne wiązanie przeciwciał po ochłodzeniu próbki.

Krótko wiruj probówkę, aby zgromadzić zawartość na dnie. Następnie należy dodać przeciwciało pierwszorzędowe. Ilość użytego przeciwciała powinna zostać mianowana dla każdej partii oraz dla każdego producenta.

W tym przypadku dodajemy 5 µg przeciwciała pierwszorzędowego, a następnie dopełniamy objętość buforem do immunoprecypitacji (buforem IP) do końcowej objętości 500 µL. Następnie próbkę DNA do IP umieszcza się w rotatorze i inkubuje w temperaturze 4 °C przez dwie godziny. Rotacja jest niezbędna, aby zapobiec aglomeracji przeciwciał w probówce podczas inkubacji.

Około 15 minut przed zakończeniem inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym, należy oczyścić i przygotować magnetyczne kulki dyna beads. Najpierw dokładnie resuspenduj kulki w fiolce za pomocą wirówki wortexowej. Następnie przenieś 30 µL kulek do czystej probówki z السيليكونizacją i umieść tę probówkę na statywie magnetycznym przeznaczonym do wielu reakcji.

Przenieś 30 µL kulek na każdą reakcję, dodając ilość wystarczającą na jedną dodatkową reakcję, aby zrekompensować błędy pipetowania lub przypadkową utratę części kulek. Na przykład dla ośmiu reakcji należy pobrać ilość kulek odpowiednią dla dziewięciu reakcji, czyli 270 µL.

Kuleczki magnetyczne zostaną przyciągnięte do ścianki statywu magnetycznego. Odczekaj dwie minuty, aż kuleczki przemieścą się i osadzą w postaci wyraźnej smugii na ściance probówki. Następnie ostrożnie usuń i odrzuć supernatant za pomocą pipety, dbając o to, aby końcówka pipety nie poruszyła kuleczkami znajdującymi się na tylnej ściance.

Zastąp supernatant nadmiarem buforu IP, wymieszaj na wortexie i ponownie umieść próbkę na statywie magnetycznym na dwie minuty. Powtórz to płukanie jeszcze raz, a następnie zawieś ponownie kuleczki do płukania w ich pierwotnej objętości buforu IP. Po zakończeniu inkubacji wyjmij probówkę z próbką z rotatora.

Aby zakończyć immunoprecypitację, należy dodać 30 µL czystych kulek do reakcji i umieścić probówkę z powrotem w rotatorze na dwie godziny w temperaturze 4 °C. Podczas tej inkubacji przeciwciało wtórne, będące przeciwciałem anty-mysie IgG, zwiąże się z pierwotnym przeciwciałem mysim. Przeciwciała anty-mysie są sprzężone z magnetycznymi kulkami DynaBeads, co umożliwia łatwe odzyskanie związanych produktów oraz przeprowadzenie kolejnego etapu oczyszczania.

Po zakończeniu inkubacji z oboma przeciwciałami, umieść probówkę do IP na statywie magnetycznym na dwie minuty. Na tym etapie zmetylowane DNA zostanie związane przez przeciwciało pierwotne, które z kolei zostanie związane przez przeciwciało wtórne skoniugowane z kulkami dyna bead. Usuń i odrzuć supernatant, a następnie zastąp go 500 µL buforu IP.

Wymieszać zawartość probówki i odstawić ją z powrotem na statyw na dwie minuty. Powtórzyć to płukanie buforem IP jeszcze raz. Po usunięciu supernatantu z ostatniego płukania Resus należy zawiesić kuleczki po raz ostatni.

W 400 µL buforu do trawienia, potraktuj próbkę reakcyjną 100 µg proteinazy K i inkubuj przez noc w temperaturze 50 °C. Traktowanie proteinazą K jest niezbędne do strawienia białek przeciwciał oraz wszelkich pozostałych białek związanych z DNA, co pozwala na uwolnienie zmetylowanego DNA do roztworu. Oczyszczanie DNA odbywa się drugiego dnia procedury; wyjmij probówkę z trawieniem z inkubatora.

W dygestorium dodać do probówki 500 µL fenolo-chloroformu w stosunku jeden do jednego o pH siedem i dokładnie wymieszać na wirówce wortex. Wirować próbkę przez 10 minut przy 13 000 g. Ostrożnie usunąć górną fazę wodną z probówki, nie naruszając interfazy ani nie usuwając warstwy organicznej. Przenieść fazę wodną do nowej probówki.

Drugą ekstrakcję można przeprowadzić, jeśli faza międzyfazowa wydaje się mętna. Następnie należy dodać jedną dziesiątą objętości trzy molowego octanu sodu, w tym przypadku 40 µL. Jako nośnik ułatwiający oczyszczanie osadu można zastosować 1 µL glikogenu.

Wymieszać zawartość probówki za pomocą wibratora vortex. Następnie dodać dwie objętości 100% etanolu, wymieszać w wibratorze vortex i zamrozić w zamrażarce o temperaturze -20 °C na 20 minut. Po zamrożeniu wytrącony DNA wirować w wirówce przy 13 000 G i temperaturze 4 °C przez 20 minut.

Na dnie probówki utworzy się osad DNA. Wyjmij probówkę z wirówki i usuń etanol. Należy uważać, aby nie naruszyć osadu znajdującego się na dnie probówki.

Może być konieczne krótkie wirowanie (tzw. pulse spin), aby usunąć resztki etanolu. W celu przemycia osadu należy dodać 500 µL zimnego 70% etanolu, wymieszać na wortexie, a następnie wirować ponownie przez 20 minut przy 13 000 G i 4 °C. Po zakończeniu drugiego wirowania należy usunąć 70% etanol, wykonać krótkie wirowanie i usunąć resztki etanolu za pomocą pipety.

Pozostaw probówkę w statywie z otwartą zakrętką, aby osuszyć pellet i pozwolić na odparowanie pozostałego etanolu. Na koniec ponownie zawiesić pellet zawierający wyłącznie DNA wzbogacone o metylację w 10 µL sterylnej wody, odczekując odpowiedni czas do całkowitego rozpuszczenia pelletu DNA przed użyciem. Dobrą praktyką jest walidacja wydajności procesu za pomocą PCR.

Można to przeprowadzić, wykonując reakcje PCR zaprojektowane do amplifikacji produktów, które różnicują zmetylowane i niezmetylowane fragmenty DNA dla starterów amplifikujących normalne ludzkie DNA. Region kontrolny imprintingowy H 19 może być stosowany w połączeniu ze starterami zaprojektowanymi do amplifikacji regionu genomu, który nie jest zmetylowany. Przykładowe sekwencje starterów oraz warunki cykli PCR znajdują się w dołączonym protokole.

Na tym etapie należy odzyskać wejściowy lub referencyjny DNA, który został odstawiony na początku protokołu meetup. Jeden zestaw reakcji PCR zostanie przygotowany z użyciem wejściowego DNA, a drugi zestaw z użyciem DNA z IP wzbogaconego pod kątem metylacji. Jeśli proces meetup przebiegł pomyślnie, PCR z IP wyprodukuje produkt z użyciem starterów do metylacji i nie wyprodukuje produktu z użyciem starterów kontrolnych.

W przeciwieństwie do tego, PCR wejściowy powinien generować produkty przy użyciu obu primerów, ponieważ zawiera fragmenty DNA zarówno zmetylowane, jak i niezmetylowane. DNA wzbogacone o fragmenty zmetylowane może być wykorzystane w wielu kolejnych zastosowaniach, takich jak sekwencjonowanie PCR i analiza mikromacierzy.

W połączeniu z innymi technikami biologii molekularnej metoda ta może być wykorzystywana do badania stanu metylacji DNA w sposób specyficzny dla konkretnego locus lub w całej obrębie genomu w celu profilowania metylacji lub badania epigenomiki.