Polerowanie pipet pod ciśnieniem w celu poprawy jakości rejestracji metodą patch-clamp
22 października 2008
Niniejszy przewodnik opisuje metodę modyfikacji kształtu szklanych mikropipet. W szczególności, poprzez zastosowanie ciepła i ciśnienia powietrza, poszerza się zwężenie pipety bez zwiększania otworu końcówki, co prowadzi do obniżenia oporu pipety. Jest to kluczowe dla uzyskania pomiarów o niskim poziomie szumów w małych komórkach, lecz znajduje zastosowanie w wielu innych obszarach.
Procedura rozpoczyna się od ustawienia końcówki pipety w pobliżu włókna polerującego przy 100-krotnym powiększeniu. Następnie należy włączyć ciśnienie powietrza oraz ogrzewanie. Włókno.
Końcówka pipety rozszerzy się, tworząc tępy kształt. Wyłącz grzanie, aby uzyskać mniejszy otwór końcówki. Ponownie wyłącz ciśnienie i grzanie.
Witam, jestem Brandon Johnson z laboratorium dr Miriam Goodman z Katedry Fizjologii Molekularnej i Komórkowej na Uniwersytecie Stanforda. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę polerowania ciśnieniowego pipet patch. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania kanałów jonowych i płatów błonowych w neuronach NC elgan.
Zacznijmy zatem. Przygotuj zestaw od sześciu do 10 pipet patch. W razie potrzeby skorzystaj z pomocy lokalnego eksperta lub obejrzyj nasz materiał wizualny dotyczący wytwarzania pipet patch i mikroelektrod za pomocą programowalnego wyciągacza.
Aby rozpocząć procedurę, ustaw ciśnienie w linii sprężonego powietrza na około 40 PS.I, a następnie podłącz linię sprężonego powietrza do czuńcowego zaworu sterującego. Podłącz odcinek plastikowej rurki do zaworu czuńcowego i przymocuj uchwyt pipety wysokociśnieniowej do wolnego końca plastikowej rurki. Do wykonania polerowania użyj zestawu mikrokuźni.
Używamy zestawu Ccpm two firmy LA Scientific. Urządzenie to posiada uchwyt do pipety wysokociśnieniowej, platynowy drut grzejny sterowany pedałem oraz mikroskop wyposażony w obiektywy o niskim i wysokim powiększeniu (10-krotnym i 100-krotnym) z długą odległością roboczą, co jest istotne, ponieważ kluczowa jest możliwość obserwacji otworu pipety podczas wykonywania procedury.
Następnie należy upewnić się, że zawór ciśnienia znajduje się w pozycji wyłączonej. Potem należy umieścić pipetę w uchwycie na pipety i dokręcić złączkę palcami, aby zapewnić bezpieczeństwo w laboratorium. Należy upewnić się, że pipeta jest mocno osadzona w uchwycie.
W przeciwnym razie ciśnienie powietrza spowoduje wysunięcie pipety z uchwytu. W ramach opcjonalnego kroku można pokryć pipetę hydrofobowym izolatorem, np. woskiem, aby zmniejszyć pojemność i poprawić charakterystykę szumów. Teraz umieść pipetę w uchwycie w pozycji mikrokucia, ustawiając uchwyt pipety na stoliku mikroskopu tak, aby zarówno końcówka, jak i włókno polerujące były widoczne przy niskim powiększeniu 10x w urządzeniu do mikrokucia.
Zbliż końcówkę na odległość około 50 mikronów od włókna, a następnie przełącz na obiektyw 100 o wysokiej rozdzielczości; zarówno końcówka pipety, jak i włókno polerskie powinny być w ostrości i znajdować się w polu widzenia. Jeśli tak nie jest, dostosuj wysokość włókna. Ponieważ pozycja pipety nie może zostać skorygowana, końcówka pipety i włókno powinny znajdować się po przeciwnych stronach pola widzenia.
Należy unikać umieszczania końcówki pipety zbyt blisko włókna, ponieważ będzie ono zwiększać swoją objętość podczas nagrzewania, co może spowodować uderzenie w pipetę. Po prawidłowym ustawieniu końcówki i włókna należy przekręcić zawór, aby skierować sprężone powietrze do pipety i nagrzewać jej końcówkę do momentu, aż zwężenie za końcówką zacznie wybrzuszać się na zewnątrz. Należy przerwać nagrzewanie, zanim końcówka wybrzuszy się zbyt mocno.
Wymagane jest przeprowadzenie eksperymentów w celu ustalenia odpowiedniej odległości, temperatury i czasu potrzebnych do uzyskania pożądanego kształtu. Jako opcjonalny krok można również polerować końcówkę bez przyłożenia nacisku, aby zmniejszyć średnicę otworu końcówki. Należy pamiętać, że etapy polerowania te można powtarzać w celu precyzyjnego dopasowania.
Dostosuj zarówno kształt, jak i wymiary końcówki pipety. Po zakończeniu polerowania wyłącz urządzenie i skieruj końcówkę pipety w bezpieczną stronę.
Wyjąć pipetę i umieścić ją w czystym pudełku do przechowywania, aby chronić ją przed kurzem. Ze względów bezpieczeństwa w laboratorium należy upewnić się, że ciśnienie zostało odcięte przed wyjęciem pipety. W przeciwnym razie może ona zostać wyrzucona z uchwytu pipety.
Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak polerować pipety ciśnieniowo w celu poprawy rejestracji w technice patch clamp. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o pokryciu cewki polerującej szkłem o wysokiej temperaturze topnienia, aby zminimalizować osadzanie się odparowanego metalu na pipetach, oraz o zachowaniu ostrożności, gdy pipety są poddane działaniu sprężonego powietrza.
Upewnij się, że pipeta jest mocno osadzona w uchwycie i wyłącz dopływ powietrza przed wyjęciem pipety z uchwytu. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie.
Życzymy owocnego polerowania naciskowego i powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy przewodnik szczegółowo opisuje modyfikację kształtu szklanych mikropipet przy użyciu ciepła i ciśnienia powietrza. Proces ten umożliwia poszerzenie stożka bez zwiększania otworu końcówki, co jest niezbędne do uzyskania rejestracji o niskim poziomie szumów w badaniach nad małymi komórkami.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Wytwarzanie mikropipet
Wstęp
- Szklane mikropipety są kluczowymi narzędziami w rejestracjach elektrofizjologicznych.
- Niższa rezystancja pipety jest niezbędna do uzyskania wysokiej jakości rejestracji.
- Modyfikacja kształtu może poprawić wydajność w różnych zastosowaniach.
- Technika ta jest szczególnie korzystna przy rejestracjach z małych komórek.
Cel badania
- Przedstawienie metody formowania szklanych mikropipet.
- Zmniejszenie oporu pipety bez powiększania otworu końcówki.
- Poprawa jakości rejestracji z małych komórek.
Zastosowane metody
- Ustawienie końcówki pipety w pobliżu włókna polerskiego przy dużym powiększeniu.
- Przyłożenie ciśnienia powietrza i ciepła w celu rozszerzenia końcówki pipety.
- Wyłączenie ogrzewania w celu uzyskania mniejszego otworu końcówki.
- Końcowe korekty poprzez wyłączenie ciśnienia i ogrzewania.
Główne wyniki
- Koniec pipety można skutecznie przekształcić w formę tępą.
- Niższą oporność uzyskuje się bez zwiększania rozmiaru końcówki.
- Metoda ta poprawia jakość rejestracji z małych komórek.
- Przedstawiono praktyczne podejście do modyfikacji mikropipety.
Wnioski
- Kształtowanie szklanych mikropipet jest cenną techniką w badaniach nad układem nerwowym.
- Udoskonalona konstrukcja pipety przekłada się na lepszą jakość danych.
- Metodę tę można zastosować w różnych badaniach elektrofizjologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Polerowanie pipet pod ciśnieniem zmniejsza oporność elektryczną w rejestracjach metodą patch-clamp bez zmiany średnicy końcówki, co umożliwia pomiary kanałów jonowych o wyższej wierności w małych populacjach neuronów. Ta ulepszona technika wspomaga walidację celów w procesie odkrywania leków w neuronauce poprzez poprawę stosunku sygnału do szumu w badaniach elektrofizjologicznych. Wyższa jakość rejestracji zwiększa pewność predykcyjną w wczesnych badaniach mechanistycznych nad pobudliwością neuronów i funkcją synaptyczną.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie funkcji kanałów jonowych w neuronach o małej średnicy, które mają kluczowe znaczenie dla celów terapeutycznych w leczeniu bólu neuropatycznego i epilepsji.
- Wartość operacyjna: Redukuje zmienność w rejestracjach pojedynczych kanałów poprzez minimalizację szumów wywoływanych przez pipetę.
Przesiewy i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie zestandaryzowanej geometrii pipet w celu zapewnienia powtarzalności paneli przesiewowych w elektrofizjologii.
- Wartość operacyjna: Kompatybilność z mikropipetami z miękkiego i twardego szkła umożliwia elastyczne projektowanie testów dla różnych klas celów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera zastosowania metody perforated-patch clamp poprzez tworzenie tępych końcówek, które zwiększają tworzenie się pęcherzyków błonowych w przypadku stosowania perforatorów antybiotykowych.
- Wartość operacyjna: Wydłuża czas rejestracji w pierwotnych kulturach neuronalnych, zwiększając przepustowość badań nad optymalizacją związków wiodących.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesne etapy procesów badawczych, w których fenotypowanie elektrofizjologiczne służy do wyboru celu molekularnego oraz profilowania związków wiodących.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia walidację funkcjonalną celów w postaci kanałów jonowych w modelach neuronalnych istotnych dla przebiegu chorób.
- Przesiewanie: Zapewnia pipety o niskiej rezystancji do wysokowiernego przesiewania związków na platformach patch-clamp.
- Analityka: Pozwala na uzyskanie ilościowych pomiarów prądu i przewodnictwa z poprawioną stabilnością sygnału.
- Badania translacyjne: Ułatwia długofalowe rejestracje w ostrych skrawkach oraz hodowlach neuronów na potrzeby modelowania farmakokinetycznego i farmakodynamicznego.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwach: Wymaga jedynie aktualizacji mikrokuźni, co czyni to rozwiązanie skalowalnym i niskokosztowym usprawnieniem istniejącej infrastruktury elektrofizjologicznej.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu dzięki czystszym fenotypom elektrofizjologicznym.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność testów pomiędzy ośrodkami i operatorami poprzez standaryzację geometrii pipet.
- Wartość strategiczna: Redukuje liczbę wyników fałszywie ujemnych w przesiewaniu kanałów jonowych poprzez minimalizację szumu technicznego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera decyzje go/no-go w programach przedklinicznych celujących w pobudliwość neuronalną.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w posługiwaniu się mikropipetami oraz w elektrofizjologii.
- Wymagany jest mikrokuźnia (microforge) wyposażona w zawór wysokociśnieniowy, drucik grzejny oraz optykę powiększającą.
- Niezbędna jest standaryzacja parametrów ciśnienia, temperatury i czasu dla wszystkich operatorów.
- Należy uwzględnić różnice w reakcji na polerowanie w zależności od rodzaju szkła (sodowo-wapniowe vs borokrzemianowe).
- Metoda jest ograniczona koniecznością ręcznego pozycjonowania końcówki oraz umiejętnościami operatora w celu uniknięcia nadmiernego rozszerzenia.
