Wytwarzanie pipet do patch-clamp oraz mikroelektrod za pomocą programowalnej wyciągarki

Szklane pipety kapilarne stały się powszechne w laboratoriach w szerokim zakresie technik, takich jak elektroporacja pojedynczych komórek, mikroiniekcja DNA oraz elektrofizjologia patch clamp. Aby przygotować szklane elektrody kapilarne do rejestracji patch clamp, wyciąga się szkło krzemianowe na programowalnym wyciągaczu. Końcówki elektrod pokrywa się woskiem, a następnie poddaje się je polerowaniu ogniowemu i przechowuje do późniejszego użycia. Witajcie, jestem Miriam Goodman z Departamentu Fizjologii Molekularnej i Komórkowej na Uniwersytecie Stanforda.

W tym filmie zaprezentuję sposób przygotowania pipet do techniki patch clamp oraz mikroelektrod ostrych do elektrofizjologii. Szklane mikroelektrody, nazywane również pipetami, od dziesięcioleci stanowią podstawowe narzędzie w elektrofizjologii. Obecnie pipety te wykonuje się z kapilar szklanych przy użyciu programowalnego wyciągacza.

Zacznijmy zatem. Do wykonania pipet do techniki patch-clamp wykorzystujemy kapilary borokrzemianowe, które są czyste i wolne od kurzu, oraz mikroelektrodowy wyciągacz Sutter P-97. Książka Sutter's Pipette Cookbook stanowi doskonały materiał referencyjny przy opracowywaniu odpowiednich programów wyciągania.

Na początek podnieś osłonę przeciwkurzową wyciągacza. Następnie wyjmij jedną szklaną kapilarę z pudełka. Pamiętaj o ponownym zamknięciu pokrywy, aby zminimalizować gromadzenie się kurzu.

Następnie, jedną ręką wsuń kapilarę w rowek po jednej stronie włókna i lekko dokręć zacisk. Na tym etapie zacisk powinien być wystarczająco mocny, aby zapobiec wypadnięciu rurki, ale na tyle luźny, by można było ją wsunąć w rowek. Teraz zwolnij sprężynowy ogranicznik metalowy po tej samej stronie.

Następnie kciukiem i palcem wskazującym chwyć metalowe zakładki przymocowane do spodu obu nośników. Zwolnij drugi sprężynowy ogranicznik. Przyciągnij nośniki do siebie tak daleko, jak to możliwe, i przytrzymaj je jedną ręką.

Następnie przesuń probówkę przez obudowę włókna do rowka nośnika po drugiej stronie. Unikaj wpychania szkła w włókno grzejne. Zaciśnij zaciski po obu stronach.

Powinny być one wystarczająco ciasne, aby utrzymać nośniki na miejscu, ale nie tak ciasne, by zmiażdżyć szkło. Teraz zamknij osłonę przeciwpyłową i naciśnij zielony przycisk. Pipetki do rejestracji patch-clamp z zaznaczonymi biegunami są formowane przy użyciu pięciostopniowego programu wyciągania z malejącą temperaturą i prędkością na każdym etapie oraz utworzeniem małego bieguna w ostatnim kroku.

Program ten wykorzystuje ciepło i grawitację. Procedura wytwarzania ostrych elektrod jest bardzo podobna, jednak w tym przypadku używamy cienkiej kapilary szklanej firmy Warner Instruments o średnicy zewnętrznej 1 mm i średnicy wewnętrznej 0,78 mm. Po zakończeniu programów wyciągania stosujemy również program wyciągania, który oprócz ciepła i grawitacji wykorzystuje silnik.

Podnieś osłonę przeciwkurzową, poluzuj oba zaciski i wyjmij gotową pipetę. Następnie umieść pipety w pudełku roboczym. Pudełko można wykonać, przyklejając pasek pianki do statywu plastikowego pudełka na końcówki do pipet, a następnie wycinając w piance od sześciu do ośmiu nacięć.

Włóż pipety do szczelin. Po zapełnieniu pudełka wyciągniętymi pipetami przejdź do etapu polerowania ogniowego w celu wypolerowania pipet. Przed rozpoczęciem polerowania ogniowego przygotuj zestaw mikrokucia z platynowym włóknem grzejnym sterowanym pedałem.

Najpierw pokryj pipetę woskiem dentystycznym, aby zmniejszyć pojemność i poprawić charakterystykę szumów. W tym celu przygotuj w pobliżu niewielki zapas roztopionego wosku. Wywieraj ciśnienie powietrza z tyłu pipety, aby zapobiec przedostaniu się wosku do końcówki.

Następnie zanurz końcówkę na krótko w płynnym wosku. Teraz ją wyjmij. Umieść pipetę w urządzeniu polerującym i zbliż końcówkę na odległość około 50 microns od włókna.

Należy pamiętać, że włókno rozszerzy się podczas podgrzewania. Zastosuj krótki impuls ciepła trwający jedną lub dwie sekundy, aby usunąć wosk z końcówki pipety i wygładzić szkło. Obejrzyj końcówki pipet pod mikroskopem, aby określić średnicę otworu oraz gładkość powierzchni.

W przypadku standardowych pomiarów metodą patch clamp otwory końcówek powinny mieć średnicę od jednej do trzech mikronów; należy odrzucić końcówki szorstkie, nierówne lub nieregularne. Gotową pipetę należy umieścić w pudełku roboczym, upewniając się, że pokrywa jest zamknięta, aby chronić pipety przed kurzem; powtórzyć czynność dla 10 prawidłowo wykonanych pipet. Przedstawiłem właśnie sposób wykonania pipet do metody patch clamp oraz mikroelektrod ostrych przy użyciu programowalnej wyciągarki.

Tę samą procedurę można wykorzystać do wykonania różnych narzędzi szklanych, w tym igieł do mikroiniekcji, w celu uzyskania optymalnych wyników w technice patch clamp. Ważne jest, aby wyciągać nowe, wolne od zanieczyszczeń pipety w dniu przeprowadzenia eksperymentu i polerować je w ciągu godziny przed badaniem. Należy również sprawdzić w ramach inspekcji, czy pipety są gładkie i wypolerowane.

Koniecznie obejrzyj nasz inny film, który demonstruje, jak przeprowadzić rejestrację patch-clamp kanałów jonowych wykazujących ekspresję w oocytach opus. To wszystko. Teraz jesteś ekspertem w posługiwaniu się pipetą, życzymy powodzenia w Twoich eksperymentach.