Métodos eletrofisiológicos de gravação Potenciais Synaptic do MNJ de larvas de Drosophila

Para obter gravações eletrofisiológicas estáveis das junções neuromusculares de larvas de Joof. Primeiro, dissecar uma larva para expor a parede corporal, os músculos e o sistema nervoso antes da gravação. Os axônios na base do SNC são cortados posteriormente ao gânglio ventral.

Em seguida, um eletrodo de registro é colocado sobre o músculo de interesse e um eletrodo estimulador é posicionado próximo aos neurônios motores inervantes. Os axônios seccionados dos neurônios motores são sugados para dentro da pipeta estimuladora. Potenciais de junção excitatórios podem então ser registrados.

Olá, sou Wendy MLA do Laboratório McCabe, do Departamento de Fisiologia e Biofísica Celular da Universidade Columbia. Hoje vamos mostrar um procedimento para medir a transmissão de tiques na junção neuromuscular de GE lava. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a fisiologia sináptica e a neurotransmissão.

Então vamos começar. Para iniciar o experimento, dissecar larvas de terceiro estágio e em jejum para expor a parede corporal. Este protocolo é modificado para experimentos eletrofisiológicos utilizando pinos de dissecação curtos.

Estes têm cerca de dois a quatro milímetros de comprimento e têm menor probabilidade de atingir o objetivo do microscópio nos eletrodos durante o experimento. Após expor a parede corporal, use pinças para segurar o SNC e levantá-lo levemente. Em seguida, corte os axônios motores dos nervos periféricos e remova o cérebro.

Após remover o cérebro, lave a preparação dissecada duas vezes com tampão HL 3.1 contendo um milimolar de cálcio. Agora que a dissecação está concluída, podem ser realizadas gravações intracelulares a partir das células musculares larvais. Coloque a placa de dissecação sob o microscópio de eletrofisiologia e submerja a preparação em tampão HL 3.1 acrescido de cálcio.

Em seguida, fixe o eletrodo de banho para que entre em contato com a solução. O eletrodo de sucção é usado para estimular os nervos periféricos que inervam o músculo. Posicione primeiramente o eletrodo de sucção na placa para evitar vibrações quando o eletrodo intracelular for colocado sobre o músculo.

Uma vez que o eletrodo esteja no recipiente, posicione-o próximo ao neurônio motor que inerva o músculo seis. No terceiro segmento abdominal, aplique sucção suave até que o nervo cortado esteja dentro da pipeta de vidro. Tenha cuidado para não esticar os nervos ao aplicar a sucção.

Levante ligeiramente a pipeta para que ela não esteja tocando o músculo. Em seguida, posicione-a de modo que não tracione as fibras nervosas cortadas. Uma vez que o eletrodo de sucção estiver no lugar, posicione o eletrodo de registro para as gravações intracelulares.

Utilize um microeletrodo afiado preenchido com cloreto de potássio três molar. Posicione o eletrodo de registro acima do centro do músculo seis. Ajuste o offset de entrada para que ele indique zero para a solução do banho.

Abaixe lentamente o eletrodo e aproxime-o do músculo sob alta ampliação óptica até tocá-lo. Para confirmar que o músculo foi penetrado, observe o osciloscópio. O potencial de repouso da membrana deve ser de pelo menos menos 60 milivolts.

Devem estar visíveis agora potenciais esporádicos miniatura da placa motora. Uma vez que o eletrodo de gravação esteja posicionado, deixe as células se estabilizarem por um minuto. Antes de iniciar as gravações, utilize um amplificador Axon HS-2 com uma cabeça de eletrodo no suporte Axclamp-2B para detectar alterações no potencial da membrana.

O grampo do eixo dois B é conectado a um computador que executa o software P clamp por meio do digitizador de dados 1322 A, o qual digitaliza o sinal. Registre o potencial da membrana em um PC. Com o software clamp X, aplique estímulos ao axônio motor para gerar potenciais de membrana excitatórios ou EJs.

Uma vez gerados os EJPs, registre os EJPs miniatura ao longo de um período de três minutos sem sinapse de estímulos. O software de análise miniatura pode ser usado para analisar os traçados e determinar a amplitude e a frequência do EJP miniatura. Para gerar EJPs.

Utilize um gerador mestre de oito pulsos para estimular a extremidade seccionada de um programa de neurônio motor. O gerador deve fornecer pulsos quadrados de tensão de 0,3 milissegundo. Um intervalo de tempo de cinco segundos entre os estímulos para permitir a recuperação sináptica.

No JNM, registre pelo menos 10 potenciais evocados de cada músculo e calcule a média das amplitudes. Esta figura mostra um traçado típico registrado do músculo seis de uma larva de sal tipo selvagem, com respostas EJP evocadas e mini EJPs espontâneas. Acabamos de mostrar como registrar potenciais do citoplasma na junção neuromuscular de larvas de drosófila. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de completar a dissecação em três a dez minutos e iniciar imediatamente as gravações eletrofisiológicas enquanto as células ainda estiverem saudáveis e responsivas.

Se a dissecação demorar muito, o potencial de repouso da membrana das células musculares será inferior a menos 60 milivolts, o que é muito baixo para ser registrado. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.