Channelrhodopsin2 Estimulação Mediated de Potenciais Synaptic em Drosophila Junções Neuromusculares
16 de março de 2009
Este procedimento utiliza um canal activado pela luz azul de algas e células específicas de ferramentas de expressão genética para evocar potenciais sinápticos com pulsos de luz na junção neuromuscular (MNJ), em Drosophila. Esta técnica é um barato e fácil de usar alternativas ao estímulo de sucção do eletrodo para estudos de fisiologia sináptica em pesquisa e laboratórios de ensino.
Este procedimento começa com o cultivo de drosófila. Terceiras larvas de instar com o genótipo apropriado são criadas em meio contendo todo o trans-retinol. Cada larva é fixada pela cabeça e pela cauda.
Em seguida, aplanar a FLA. O cérebro e os nervos posteriores são então cortados para interromper a atividade motora rítmica. A seguir, a fonte de luz LED azul com caixa de controle é ajustada e focalizada na preparação.
Por fim, utilize um eletrodo afiado para penetrar o músculo seis. Em seguida, aplique pulsos de luz com uma fonte de voltagem. Olá, sou Nicholas Marstein do laboratório da Dra. Leslie Griffith, do Departamento de Biologia da Universidade Brandeis.
Olá, sou Stefan Pulver, também do Laboratório Griffith. Hoje vamos mostrar a vocês o procedimento para evocar potenciais sinápticos com canal ausente do tipo dois na junção neuromuscular da larva de drosófila. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a fisiologia sináptica e a drosófila.
Também utilizamos isso para ensinar fisiologia sináptica e laboratórios didáticos. Então, vamos começar. Para iniciar este protocolo, mantenha as linhagens de moscas UAS channel redsin dois e OK, 3 7, 1 gal quatro em frascos separados contendo meio padrão para moscas.
Colete virgens das linhagens de moscas 3 7, 1 gal, quatro e machos das linhagens UAS channel redsin. Duas linhagens. Em seguida, prepare o meio para moscas misturado com um milimolar de all trans retinol ou a TR. Para fazer isso, derreta o meio comum para moscas em um micro-ondas por aproximadamente um minuto.
Uma vez derretido, deixe o meio esfriar por cerca de 30 a 60 segundos e, em seguida, adicione 100 microlitros de TR 100 milimolar em etanol a 100% para cada 10 mililitros de meio para moscas. Quando os frascos contendo o meio com TR estiverem prontos, coloque os machos e fêmeas coletados em cada frasco. Coloque os frascos em um local escuro a 22 a 25 graus Celsius para que as moscas acasalem e depositem ovos; espere de quatro a cinco dias até que larvas de terceiro estágio sejam visíveis.
Neste momento, você pode descartar as moscas adultas. Agora estamos prontos para prosseguir com a montagem do equipamento de eletrofisiologia. Conecte qualquer ocular de microscópio de dissecação a uma fonte de luz LED azul com dissipador de calor.
Use um suporte e uma braçadeira para fixar uma base magnética na ocular e na fonte de luz LED. Coloque a base magnética na mesa pneumática do sistema de eletrofisiologia. Em seguida, conecte a fonte de luz a um circuito de controle e, depois, conecte o circuito de controle a uma fonte de tensão externa.
Utilizamos a saída de tensão do sistema de aquisição de dados de eletrofisiologia PowerLab fabricado pela AD Instruments. Após conectar à fonte de tensão, aplique pulsos de um a cinco volts ao circuito de controle para ativar a luz azul, ajuste a base magnética e a fonte de luz até que o feixe de luz azul esteja focado na área que será ocupada pela dissecação larval. Após realizar os ajustes adequados, estamos prontos para prosseguir com a dissecação larval.
Para iniciar a dissecação, insira seis pinos de 0,1 milímetro no fundo de uma placa Sögarh. Remova larvas de terceiro instar do meio de cultura e coloque-as em uma placa de Petri de plástico. Lave as larvas com solução salina para remover qualquer alimento aderido às larvas.
Em seguida, coloque as larvas na placa de dissecação próximo aos alfinetes esticados e encha a placa até a metade com solução salina. Agora, posicione as larvas de modo que você possa ver dois tubos prateados percorrendo a superfície dorsal do animal. Esses tubos prateados são a traqueia.
Insira um alfinete grande diretamente na cauda, entre os tubos traqueais. Segure as larvas para baixo e coloque um segundo alfinete grande na cabeça. Certifique-se de esticar o corpo longitudinalmente ao inserir o alfinete.
Use uma tesoura para fazer uma pequena incisão próxima à cauda. Continue a incisão ao longo do comprimento do corpo. Certifique-se de manter as pontas da tesoura levantadas para evitar cortar os nervos ventrais e/ou os músculos da parede corporal.
Coloque quatro pinos nos quatro cantos do animal. Agora abra a região mediana. Insira os pinos no recipiente de dissecação para eviscerar o animal.
Prenda também a preparação para que ela seja dissecada usando pinças e tesoura. Remova os órgãos digestivos, a traqueia e os corpos adiposos do animal. Enxague a preparação com solução salina.
Após a lavagem, localize os lobos frontais e o gânglio ventral da preparação utilizando tesoura microcirúrgica. Corte cuidadosamente o gânglio ventral logo atrás dos lobos frontais. Uma vez concluída a dissecação, prossiga com a estimulação com luz azul e a gravação da atividade muscular.
Para realizar a gravação muscular, puxe um eletrodo com resistência de 10 a 20 megaohms. Usando um puxador eletrônico de eletrodos, preencha o eletrodo puxado com KCl 3 molar. Coloque o eletrodo preenchido no suporte de eletrodo.
Agora, posicione a preparação larval sob um microscópio estereoscópico no aparato. Ajuste a luz azul para que a preparação dissecada fique centralizada no feixe de luz. Identifique o músculo seis ou M seis em qualquer segmento da parede corporal da larva usando um micromanipulador, insira cuidadosamente o eletrodo no M seis e observe a rápida hiperpolarização muscular.
Os potenciais de membrana em repouso devem variar de trinta milivolts negativos a setenta milivolts negativos. Uma vez que o eletrodo seja inserido corretamente, aplique pulsos de tensão de 20 a 100 milissegundos ao circuito de controle. Aumente progressivamente a tensão fornecida ao circuito de controle.
Observe os potenciais de junção excitatórios na célula muscular. Aqui está um resultado representativo que mostra um potencial de junção excitatório evocado por pulsos luminosos curtos. A amplitude do potencial de junção excitatório mostrada aqui é a amplitude somada de dois neurônios motores que se sabe que ingerem.
M seis. Intensidades mais baixas ou durações mais curtas de luz podem revelar o potencial de junção excitatório de menor amplitude proveniente de um único neurônio motor. Acabamos de mostrar como realizar a estimulação mediada por canal road ausente dois dos potenciais sinápticos na junção neuromuscular oph.
Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de não danificar a parede corporal da preparação durante a dissecação. Também é importante lembrar que, embora uma preparação possa estar superexcitada logo após a dissecação, ela se acalmará com o tempo e permitirá boas gravações. Ao penetrar os músculos, tenha cuidado para não ultrapassar a primeira camada muscular e atingir a parede corporal.
Quando seu eletrodo fica preso na parede corporal, você pode às vezes obter potenciais hiperpolarizados, mas na verdade não estar dentro de uma célula muscular. É isso aí.
Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este procedimento utiliza um canal algal ativado por luz azul e ferramentas genéticas específicas para células para evocar potenciais sinápticos com pulsos de luz na junção neuromuscular (JNM) em larvas de Drosophila. Esta técnica é uma alternativa econômica e de fácil uso à estimulação com eletrodo de sucção para estudos de fisiologia sináptica em laboratórios de pesquisa e ensino.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Fisiologia Sináptica
- Expressão Genética
Contexto
- Larvas de Drosophila são comumente usadas em pesquisas de neurociência.
- Canais ativados pela luz fornecem um método não invasivo para estudar a atividade sináptica.
- Métodos tradicionais, como a estimulação com eletrodo de sucção, podem ser complexos e onerosos.
- Este procedimento tem como objetivo simplificar o processo de evocar potenciais sinápticos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para estudar a fisiologia sináptica utilizando estimulação luminosa.
- Fornecer uma alternativa acessível para fins educacionais e de pesquisa.
- Aprimorar a compreensão dos mecanismos sinápticos na junção neuromuscular.
Métodos Utilizados
- Criar larvas de Drosophila em alimento específico.
- Imobilizar as larvas para preparação à estimulação.
- Seccionar o cérebro e os nervos posteriores para interromper a atividade motora.
- Utilizar uma fonte de luz LED azul para evocar potenciais sinápticos.
Resultados Principais
- Evocação bem-sucedida de potenciais sinápticos utilizando pulsos de luz.
- Demonstração da eficácia do canal algal ativado por luz azul.
- Validação do método como uma alternativa confiável às técnicas tradicionais.
- Potencial para aplicações mais amplas na pesquisa de fisiologia sináptica.
Conclusões
- O método ativado pela luz é eficaz para o estudo da fisiologia da junção neuromuscular.
- Essa abordagem pode facilitar pesquisas e o ensino em neurociência.
- Estudos futuros podem explorar aplicações adicionais dessa técnica.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a estimulação não invasiva, baseada em luz, da atividade sináptica em um modelo geneticamente manipulável, reduzindo as barreiras técnicas nos fluxos de trabalho de neurofisiologia. Ele possibilita a geração de dados reprodutíveis para a validação de alvos na fase inicial de descoberta, especialmente em situações onde a manipulação manual de eletrodos limita a produtividade ou a eficiência do treinamento. A abordagem aumenta a confiança preditiva ao fornecer uma alternativa padronizada e escalonável à estimulação com eletrodo de sucção em estudos da junção neuromuscular de Drosophila.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação dos mecanismos de transmissão sináptica por meio da ativação neuronal precisa e controlada por luz.
- Valor Operacional: Reduz a dependência de manipulações tecnicamente desafiadoras com eletrodos de sucção, melhorando a consistência do ensaio entre diferentes usuários.
- Valor Estratégico: Possibilita a triagem fenotípica de alta fidelidade de moduladores genéticos ou farmacológicos da função sináptica.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera potenciais juncionais excitatórios (PJE) quantificáveis como uma medida direta da eficácia da transmissão neuromuscular.
- Valor Operacional: Permite a padronização de parâmetros de estimulação por meio do controle de pulsos de LED azul, melhorando a reprodutibilidade entre experimentos.
- Valor Estratégico: Facilita a miniaturização de ensaios e sua adaptação para triagem de compostos em telas de neurotoxicidade ou neuroterapêutica baseadas em Drosophila.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Fornece um sistema relevante para a doença no estudo de vias sinápticas conservadas com acessibilidade genética.
- Valor Operacional: Permite o acompanhamento longitudinal de fenótipos sinápticos em modelos larvais com variabilidade mínima de preparação.
- Valor Estratégico: Apoia a redução mecanicista de riscos de alvos envolvidos na transmissão neuromuscular ou na liberação de neurotransmissores.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial como uma modalidade de estimulação para avaliar a função sináptica antes das etapas de otimização de compostos líderes.
- Biologia da Descoberta: Permite testar hipóteses sobre a excitabilidade neuronal e os mecanismos de liberação de vesículas sinápticas por meio de pulsos luminosos controlados.
- Triagem: Fornece amplitudes padronizadas e quantificáveis de PJE adequadas para avaliar perturbações genéticas ou químicas.
- Análise: Gera saídas contínuas de traçado de tensão, permitindo a análise de amplitude, tempo de ascensão e frequência dos eventos sinápticos.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se a mecanismos sinápticos conservados, relevantes para distúrbios neuromusculares humanos, por meio de ortologia genética.
- Reutilização Empresarial: Representa uma plataforma de estimulação reutilizável, adaptável a múltiplos genótipos larvais e condições experimentais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação do alvo ao reduzir a variabilidade de medição decorrente de artefatos de posicionamento do eletrodo.
- Valor Operacional: Melhora o rendimento do laboratório e a eficiência do treinamento em ambientes educacionais e de pesquisa por meio de uma configuração de estimulação simplificada.
- Valor Estratégico: Reduz as barreiras técnicas para ensaios de fisiologia sináptica, permitindo maior acesso da equipe e colaboração multifuncional.
- Impacto no Portfólio: Apoia decisões de seguir ou não seguir na priorização de alvos ao fornecer leituras sinápticas confiáveis e de alta fidelidade.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em genética de Drosophila, eletrofisiologia e sistemas de estimulação óptica.
- Requer fonte de luz LED azul, circuito de controle de voltagem e aparato para eletrofisiologia com solução salina.
- Demanda padronização na alimentação com retinal, estagiamento larval e protocolos de dissecação entre os usuários.
- Limitado a alvos musculares superficiais devido às restrições de penetração da luz em preparações intactas.
- Depende da expressão funcional de ChR2 e da disponibilidade do cofator (retinal todo-trans) em neurônios motores.
