Microinjeção de mRNA e Oligonucleotídeos Anti-Senso Morpholino em embriões Zebrafish.

Este procedimento começa com a preparação do mRNA com capuz transcrito in vitro e morfo. Uma micropipeta é preenchida por sucção com a solução contendo morfo e, em seguida, o volume de injeção é calibrado utilizando um micrômetro em embriões na fase de uma célula. Em seguida, embriões de peixe-zebra são coletados e organizados em uma câmara de microinjeção para injeções microscópicas no vitelo.

A solução de trabalho é injetada na gema logo abaixo da célula, e os movimentos citoplasmáticos são utilizados para transportar a solução para microinjeções celulares. Injete a solução no citoplasma celular após as injeções. Incube os embriões a 28,5 graus Celsius em meio E3 e avalie os fenótipos de interesse em estágios subsequentes.

Olá, sou Shiloh Yuen do laboratório, filho do Dr. Sasha e do Departamento de Genética da Escola de Medicina da Universidade de Yale. Hoje demonstraremos uma técnica robusta de microinjeção para realizar estudos de superexpressão de mRNA e silenciamento gênico com oligonucleotídeos morfolinos em peixe-zebra. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar o papel do S cílio nas doenças renais císticas.

Então vamos começar. Uma abordagem poderosa para estudos de função gênica é a microinjeção de RNA transcrito in vitro e cappingado em embriões de peixe-zebra. Nesta demonstração, realizaremos a microinjeção de um transcrito marcado com EGFP e utilizaremos a expressão de GFP em embriões inteiros vivos como um indicador visível de injeção bem-sucedida.

Primeiro, realizaremos uma reação de transcrição in vitro de RNA com capuz no transcrito de interesse. Em nosso laboratório, inserimos rotineiramente o A-C-D-N-A de interesse em um vetor PCs dois mais e realizamos uma reação de síntese in vitro para produzir grandes quantidades de RNA com capuz, utilizando o kit M message M machine SP seis. Em seguida, purificaremos a amostra de RNA utilizando o kit RN easy mini ou por extração com fenol-clorofórmio e precipitação com isopropanol.

Determine cuidadosamente a concentração da preparação de RNA e armazene-a a menos 80 graus Celsius até o momento de uso no dia da injeção. Descongele a amostra de RNA, vortexie levemente e centrifugue brevemente. Agora, prepare uma solução de trabalho com água estéril e uma concentração final de 0,025 a 0,05% de vermelho de fenol; o vermelho de fenol atua como marcador visível para a injeção da solução no embrião.

Aqui, vamos preparar uma solução de trabalho contendo 100 nanogramas por microlitro de mRNA de EGFP com 0,05% de vermelho de fenol. Por fim, mantenha a amostra de trabalho em gelo e retorne o estoque de RNA a menos 80 graus Celsius. Prossiga para a preparação do morfo quando estiver pronto para injetar esta amostra.

Os oligonucleotídeos antisense morfino são amplamente utilizados para modificar a expressão gênica ao bloquear a tradução de uma proteína específica ou ao modificar o splicing do pré-mRNA. Os morfolinos em peixe-zebra funcionam como uma poderosa ferramenta de genética reversa ao inibir a função gênica. Aqui, realizaremos microinjeção de um oligo morfolino direcionado ao sítio de iniciação da tradução de pkd2. Usamos rotineiramente 300 M de um oligo morfolino, especificamente projetado para um gene de interesse, obtido da Gene Tools LLC.

Em seguida, adicionamos 100 microlitros de água estéril para obter uma solução estoque de três milimolares e, então, alíquotas da solução são armazenadas a menos 20 graus Celsius até o momento de uso no dia da injeção. Aquecemos a solução morino a 65 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, resfriamos rapidamente a solução em gelo imediatamente e centrifugamos brevemente; este passo desnatura quaisquer estruturas secundárias no oligo e garante que a solução esteja completamente solubilizada.

Em seguida, prepararemos uma solução de trabalho diluindo a solução Morpho em água estéril e uma concentração final de 0,025 a 0,05% de vermelho de fenol. Nesta demonstração, prepararemos uma solução de trabalho de 0,5 milimolar de PKD dois morino com 0,05% de vermelho de fenol. Mantenha a solução de trabalho em temperatura ambiente e prossiga para o enchimento da micropipeta quando estiver pronto para injetar esta amostra.

Para começar, precisaremos fabricar micropipetas a serem usadas para as injeções. Isso é feito aquecendo e puxando tubos capilares de vidro silicato BOS em um dispositivo polarizador de micropipetas. Uma vez puxadas, as micropipetas são mantidas em uma placa de Petri sobre uma pequena quantidade de argila ou fita adesiva.

Em seguida, prepararemos placas de câmara de microinjeção despejando 1,5% de aros em placas de meio XE três moldadas com canais em formato de cunha. Isso servirá como um método simples para segurar os embriões durante a injeção. As placas da câmara de aros são então deixadas para solidificar e armazenadas a quatro graus Celsius até estarem prontas para serem utilizadas.

Para começar a encher a micropipeta, corte a ponta distal com pinça ou lâmina cirúrgica para criar uma abertura que seja apenas visível sob um microscópio estereoscópico com ampliação de 50x. Em seguida, coloque dois microlitros da sua solução de trabalho.

Como uma gota sobre uma lâmina de cobertura, fixe a extremidade traseira de uma micropipeta a uma seringa de cinco mililitros equipada com tubo em uma agulha hipodérmica e leve levemente a ponta distal da micropipeta até a gota da solução de trabalho. Tenha cuidado para não quebrar a ponta da micropipeta. Aspire a solução de trabalho através da extremidade distal da micropipeta puxando o êmbolo da seringa.

Em seguida, calibraremos o volume de injeção da micropipeta. Coloque uma gota de óleo mineral em uma lâmina micrométrica e ligue a alimentação elétrica e o suprimento de ar ao aparelho de microinjeção por pulso de pressão. Em seguida, acople a micropipeta ao suporte de micropipeta do aparelho de microinjeção.

O microinjetor é regulado por pressão e as descargas são ativadas pressionando o pedal com o pé sob o microscópio de dissecação. Teste o volume de injeção utilizando o microinjetor para colocar uma gota da sua solução de trabalho sobre o óleo do micrômetro. Meça o diâmetro da gota enquanto ela flutua como uma esfera na superfície do óleo.

Ajuste a duração e a pressão da injeção para calibrar cuidadosamente o volume de injeção. Este passo auxilia na reprodutibilidade do experimento de microinjeção. Nesta demonstração, todas as microinjeções serão realizadas com um diâmetro de gota de 0,15 milímetros.

Por fim, uma vez que o volume de injeção tenha sido calibrado, use o botão de retenção no microinjetor para evitar o preenchimento reverso e o vazamento da micropipeta. Agora é a hora de preparar os embriões de peixe-zebra. Os peixes-zebra acasalam-se aleatoriamente nas primeiras horas de cada manhã; para iniciar o preparo, colete os embriões no estágio de uma célula e coloque-os em meio 1 XE 3.

Usando uma pipeta de transferência de três mililitros, posicione os embriões ao longo dos sulcos em forma de cunha nas placas da câmara de microinjeção. Remova o meio para que os embriões fiquem parcialmente submersos e não inundados. Este passo auxilia no acomodamento dos embriões no fundo dos sulcos, bem como na penetração do corion pela micropipeta.

Agora iniciaremos as injeções. Primeiro, manipularemos os embriões com a micropipeta para que o citoplasma do embrião em estágio de uma célula fique visível sob o microscópio estereoscópico. Tenha cuidado para não quebrar a ponta da micropipeta; penetre a coriona e, em seguida, o vitelo com a micropipeta, a fim de injetar no embrião.

Nesta demonstração, realizaremos primeiramente uma microinjeção diretamente no vitelo abaixo da célula, permitindo que o citoplasma e a difusão transportem a solução de trabalho para dentro da célula. Esse fluxo é visível devido ao vermelho de fenol adicionado à solução de trabalho. Como este é um embrião de célula única, pode ser injetado manualmente ou com um manipulador.

Também demonstraremos a injeção direta no citoplasma celular. A microinjeção direta na célula é mais robusta, mas consome mais tempo, pois exige a orientação adequada do embrião e técnica de microinjeção precisa. Como a membrana celular é mais resistente que a membrana do vitelo, muitas vezes é mais rápido introduzir a micropipeta através do vitelo para alcançar a célula.

Orientar o citoplasma com o polo animal voltado para o fundo do sulco e trabalhar com as mãos firmes pode auxiliar neste método de injeção. Após a microinjeção, coloque os embriões em uma placa de Petri com meio E3 e incube-os a 28,5 graus Celsius para o desenvolvimento normal. Nas próximas horas e dias de desenvolvimento embrionário, observe os embriões quanto aos fenótipos de interesse.

Para verificar o sucesso da microinjeção, monitoraremos a expressão de GFP em embriões em desenvolvimento a partir da fase de escudo, utilizando microscopia de fluorescência em embriões inteiros in vivo. A expressão do construto é mais intensa durante os eventos iniciais do desenvolvimento embrionário e frequentemente diminui ao longo do desenvolvimento, à medida que o RNA tampado injetado é gradualmente degradado e depende da estabilidade da proteína expressa. Com base em resultados previamente publicados, esperamos que o morfante de PKD2 imite a curvatura do eixo corporal dorsal observada em peixes-zebra mutantes para PKD2 e apresente cistos renais aproximadamente entre dois e três dias após a fertilização.

Acabamos de mostrar a você uma técnica robusta de microinjeção para realizar estudos de superexpressão de mRNA e silenciamento gênico com oligonucleotídeos morfolinos em peixe-zebra. Ao realizar este procedimento, lembre-se de que é importante injetar com a mão firme. É isso aí.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.