Micromanipulação de expressão gênica no cérebro adulto Zebrafish Usando microinjeção Cerebroventricular de Morpholino Oligonucleotides

O objetivo geral deste procedimento é microinjetar oligonucleotídeos morfológicos no ventrículo cerebral do cérebro do peixe-zebra adulto e derrubar a atividade dos genes nas células radiogliais. Isso é feito primeiro anestesiando o peixe-zebra. Em seguida, uma fenda é gerada no crânio, sobrepondo o tum óptico usando uma agulha de amassado farpado.

Em seguida, a solução morfo é injetada através do local da incisão no fluido ventricular cerebral. Finalmente, a eficiência e a precisão da injeção são verificadas no microscópio de fluorescência. Em última análise, podem ser obtidos resultados o bloqueio muito eficiente e generalizado da produção de proteínas a partir dos genes de interesse nas células gliais radiais do cérebro adulto do peixe-zebra por meio do knockdown do gene mediado por morfo, que pode ser testado por cortes histológicos e colorações imuno-histoquímicas.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como abordagens transgênicas ou métodos de entrega baseados em eletrooperação, é que o CVMI consome menos tempo e é mais eficiente em atingir toda a população de células radiogliais. Esses genes ajustáveis e muitos podem ser derrubados ao mesmo tempo. Para preparar a mistura de injeção, comece fazendo uma solução de estoque Morpho 500 Micromolar.

Usando PBS para 10 injeções, prepare 10 microlitros de mistura de injeção combinando nove microlitros de solução morfo diluída ou não diluída com um microlitro de um corante fluorescente de rastreamento. Armazene-o em temperatura ambiente. Use um extrator de agulha para preparar capilares de injeção de vidro de acordo com os seguintes parâmetros.

Ligue a fonte de pressão e ajuste as configurações de pressão para 50 PSI ou 3.5 bar. Ajuste as configurações do microinjetor da seguinte forma. Pressão de retenção: 20 PSI, pressão de ejeção, 10 PSI, valor do período: 2.5 e 100 milissegundos.

Faixa de gating. Ligue o iluminador de anel e localize o anel sobre a platina do microscópio. Coloque o suporte capilar em uma posição apropriada ao lado do microscópio.

Insira o capilar de vidro no suporte e ajuste o ângulo de injeção para 45 graus. Usando uma pinça de extremidade, retire a ponta do capilar de vidro e calibre a saída de pressão do orifício. Mergulhando a ponta da agulha na água dos peixes e aplicando um pulso de pressão contínuo, as bolhas de ar devem formar uma única fileira indicando a pressão ideal ou o tamanho do orifício.

Carregue o capilar de vidro com a solução de injeção. Evitando bolhas de ar, aplique pressão para remover o ar entre a ponta do capilar de vidro e a solução de injeção carregada. Depois de preparar uma solução de caule a 0,1% do anestésico, transfira o número desejado de peixes para um recipiente de transporte com água de peixe.

Prepare uma solução de trabalho de anestésico misturando 200 mililitros de água de peixe com cinco mililitros de solução estoque MISP. Encha uma placa de Petri até a metade com o anestésico para usar em injeções. Incube um peixe no anestésico até que ele pare de se mover.

Em seguida, use uma rede para transferi-lo para a placa de Petri do anestésico. Para facilitar a incisão, use a pinça para segurar suavemente o peixe e orientá-lo com a cabeça ligeiramente inclinada para baixo. Usando a ponta de uma agulha farpada de calibre 30, faça um pequeno corte no crânio sem penetrar muito profundamente, pois isso causará danos ao tecido cerebral.

Enquanto continua a segurar o peixe, insira a ponta do capilar de vidro através do local da incisão cerca de meio milímetro e, evitando o contato com o tecido cerebral, oriente-o em direção ao céfalo. Injete a solução, ela deve se dispersar imediatamente. Transfira o peixe para água doce e deixe-o recuperar.

Cerca de 30 minutos depois, reanestesiar o peixe e verificá-lo em um microscópio de fluorescência para procurar a distribuição generalizada do líquido. Com base na fluorescência vermelha. Retorne o peixe ao tanque e coloque-o de volta em circulação.

Até o uso para análises comportamentais ou para preparar amostras de tecido, como visto aqui, uma injeção precisa leva à dispersão da solução injetada por todo o cérebro e ao direcionamento eficiente das células próximas à superfície ventricular. No entanto, injeções em que o capilar de vidro empala o tecido cerebral terá um sinal fluorescente denso no ponto de injeção. E se a quantidade injetada não for suficiente, um sinal fluorescente fraco será observado.

Esta figura demonstra que os morfos vivos podem penetrar alguns diâmetros celulares dentro da superfície ventricular e, portanto, podem atingir eficientemente as células ventriculares em comparação com o controle. Morpho. A injeção de morfo contra PCNA reduz eficientemente a expressão gênica nas células ventriculares. Nessas imagens de imunofluorescência, a imunocoloração BRDU e QCD após o experimento de perseguição de pulso A-B-R-D-U demonstra que o knockdown de PCNA com morfoses antisense leva a uma redução significativa nos neurônios recém-nascidos, sugerindo que o CVMI pode ser usado para derrubar genes endógenos que subsequentemente dão origem a consequências funcionais.

Assim, após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores do campo da neurociência explorarem os mecanismos moleculares envolvidos na resposta da neurogênese regeneradora do S adulto do cérebro de peixes.