Visualizando CD4 + antígeno específico Células T usando MHC Classe II tetrâmeros

Bem, o que é realmente único no ensaio Teer é que ele permite visualizar diretamente as células T específicas para antígenos. O te, o teer é o principal aspecto único do nosso ensaio. Isso é combinado com uma etapa de amplificação que realizamos.

Você sabe, isolamos os linfócitos T e então os cultivamos em um ambiente que enriquece a amostra com os linfócitos T que nos interessam. Em seguida, conseguimos rotular especificamente apenas essas células e visualizá-las em um citômetro de fluxo. Assim, com ensaios anteriores, como o CSFE ou ensaios de proliferação que existem há décadas, o que se obtém são apenas medições globais do que está ocorrendo com toda a população de linfócitos T.

Mas você possui milhões de células T no organismo, e elas reconhecem um conjunto inteiro e diversificado de padrões. Se tiver sorte, talvez uma em cada 200 a 300.000 células da amostra seja aquela que você está procurando. E é por isso que este ensaio realiza essas etapas de enriquecimento.

E então, com um número de teste, e porque você está corando diretamente, é possível visualizar, mesmo com fundo baixo, uma população que representa menos de 1% do número total de células. Assim, é possível observar diferenças muito, muito pequenas e obter uma contagem bastante precisa do número de células T presentes nessa amostra de sangue, ou seja, do número de células T nesse indivíduo que reconhecem o seu padrão de interesse. Mas não para por aí, porque os tetraméricos também permitem não apenas rotular essas células T, mas isolá-las para análises posteriores.

E os tetrameros que vocês utilizam são na verdade produzidos aqui no BRI, isso está correto? Sim. Somos um dos pouquíssimos laboratórios do país que conseguiram produzir com sucesso tetrameros da classe dois. Nosso objetivo é distribuir esses reagentes por custo a quaisquer laboratórios interessados em adotar esta tecnologia.

O que você consideraria os aspectos mais difíceis ou desafiadores deste ensaio no que diz respeito à sua replicação em outros laboratórios? Bem, ao refletir sobre isso, existem realmente dois: o crescimento dos linfócitos T. É algo que realmente é um pouco uma arte.

Você tem decisões quase diárias quanto à necessidade de nutrientes adicionais ou de mais espaço para o crescimento das células. E então, a segunda parte, que acredito ser provavelmente a mais difícil para um operador inexperiente, é a análise dos dados. Identificar qual parte do sinal realmente representa uma resposta positiva e qual parte é apenas inerente à física e à atração.

E o fato de que tudo possui certo grau de aderência é algo que, novamente, exige muita experiência, especialmente em contextos nos quais a resposta geral será um pouco fraca. Como as informações que você gerará com este ensaio têm potencial para beneficiar os pacientes neste momento? Um dos primeiros indicadores que surge em qualquer paciente com doença autoimune é uma espécie de constelação de anticorpos específicos para essa doença.

Sabemos pelos princípios fundamentais da imunologia que, sempre que há uma resposta de anticorpos, há primeiramente uma resposta de células T. Assim, se pudéssemos observar em indivíduos em risco esse aumento na atividade das células T que antecede a formação de anticorpos, isso nos ajudaria a definir um novo nível de risco ou a identificar indivíduos que estão caminhando para desenvolver autoanticorpos, o que, esperançosamente, abriria uma janela para terapias intervencionistas. Este procedimento irá purificar e expandir células T positivas para CD4 específicas para antígenos e visualizá-las utilizando reagentes tetraméricos e equipamentos em cabines de segurança biológica classe dois com fluxo laminar.

Este será o espaço de trabalho principal para o procedimento. Tubos cónicos de 50 mililitros, tubo principal para o isolamento de PBMC, um XPBS. Este deve ser livre de cálcio e magnésio, embalado em folha de alumínio para proteger da luz, pipetador auxiliar, pipeta CoStar de 10 mil, recipientes de aerossol com inserções de 50 mil utilizados para prevenir a contaminação do centrifugador com sangue.

Pipetas para centrífuga GS six R, pipetas de Pasteur, tampão hemolítico contendo 8,3 gramas por litro de cloreto de amônio, 1,0 grama por litro de bicarbonato de sódio, 0,04 gramas por litro de EDTA dissódico, solução de trian azul a 0,2% em PBS, hemocitômetro, tubo cônico de 15 mililitros, tampão de corrida contendo PBS suplementado com dois milimolares de EDTA mais cinco gramas por litro.

Kit de isolamento BSA max CD quatro, dois adquiridos da Milin Biotech; bloco magnético EP adquirido da Stem Cell Technologies. Outras plataformas de enriquecimento celular magnético podem ser utilizadas com eficácia equivalente. Tubo de polipropileno de cinco mililitros; RPMI 1640 suplementado com 25 milimolar de HEPES, utilizado para preparar o meio para linfócitos T; soro humano em pool utilizado para suplementar o meio para linfócitos T; pen strep utilizado para suplementar o meio para linfócitos T; filtro estéril de 500 mililitros com membrana de 0,22 mícron em frasco com tampa de rosca; placa estéril de 48 poços utilizada para cultura de expansão in vitro, passo; incubadora a 37 graus Celsius com atmosfera de CO2; solução de 20 miligramas por mililitro de peptídeo sintético contendo o epítopo de interesse.

Tubo de fax de poliestireno de 5 mL com peptídeo carregado da classe dois TEEr utilizado para visualizar linfócitos T específicos para antígenos, anticorpos anti-CD3, anti-CD4 e anti-CD25 utilizados para revestir linfócitos T específicos para antígenos. Citômetro de fluxo Fax Caliber ou equivalente antes de iniciar o procedimento. Reúna todos os materiais e equipamentos em sua área de trabalho.

A demonstração a seguir abrangerá os seguintes passos: isolamento de PBMC, separação de células T CD4 positivas, cultura de expansão in vitro e visualização de células T por microscopia ou coloração. Passo um: isolamento de PBMC.

Obtenha uma amostra de sangue. O sangue deve ser coletado em seringas ou tubos para sangue e anticoagulado com heparina na proporção de um para cinquenta para prevenir coagulação, esperando-se um rendimento de cerca de 1 milhão de PBMC por mililitro de sangue. Cerca de 40% dessas células serão linfócitos T positivos para CD4.

Aliquotar o sangue em tubos cónicos de 50 mililitros. 25 mililitros de sangue por tubo. Misturar suavemente o sangue antes do coágulo ALI para distribuir o plasma.

Adicione PBS, completando o volume total a 40 mililitros, e sobrepõe-se ao adicionar cuidadosamente 11 mililitros do frasco inserindo-o no tubo de sangue e removendo com cuidado a ajuda de pipeta da pipeta. O frasco drenará lentamente até o fundo do tubo. Uma vez que o nível se estabilize, remova lentamente a pipeta do tubo de sangue, descarte a tampa, feche os tubos de sangue e transfira-os para o aerossol dos cilindros.

Feche firmemente os frascos e centrifugue a 900 vezes G por 20 minutos sem freio. É fundamental que nenhum freio seja aplicado ao final desta centrifugação, pois a força de frenagem pode perturbar a camada de células após a rotação. Os PBMCs devem formar uma camada branca distinta entre o plasma amarelo acima e o Fial transparente abaixo.

Remova cuidadosamente a camada de células brancas do sangue usando uma pipeta de transferência e transfira para um novo tubo. Algum plasma e fial podem ser aspirados junto com os pbmc, mas evite aspirar qualquer parte da camada de células vermelhas. Normalmente, dois tubos de sangue podem ser combinados em um único tubo de células nesta etapa.

Para aumentar o tamanho do pellet, adicione PBS até completar um volume total de 15 mililitros e centrifugue a 500 vezes G durante 15 minutos com freio baixo e aspire o líquido dos frascos com um pipeta de Pasteur, tomando cuidado para não perturbar o pellet. Trate com o tampão hemolítico adicionando de cinco a seis mililitros em cada tubo e misture suavemente para remover grumos. Incube por não mais de cinco minutos.

Adicione PBS, completando o volume total a 50 mililitros, e centrifugue a 230 ×g por 10 minutos. Em velocidades mais baixas, os frascos com aerossol não são mais necessários para essas centrifugações mais lentas. Lave duas vezes, aspire o líquido utilizando uma pipeta de Pasteur, reconstitua o tubo com PBS e centrifugue a 230 ×g por 10 minutos antes do passo final de lavagem. Retire uma alíquota das células re-suspensas, dilua com azul de tripano e conte utilizando um hemocitômetro.

Essa contagem de células determinará os volumes de reagentes utilizados na separação de linfócitos T. Passo dois, separação de linfócitos T positivos para CD4, aspire o líquido e adicione o tampão de corrida para elevar o volume total a 40 microlitros por 10 milhões de células. Normalmente, isso requer 30 microlitros de tampão mais o volume residual do pellet.

Transfira este volume para um tubo cônico de 15 mililitros. Adicione o coquetel de anticorpos dos kits de isolamento de CD4, 10 microlitros por 10 milhões de células por tubo, e coloque no gelo por 10 minutos. Retire o tubo do gelo, remova a tampa e adicione 30 microlitros de tampão de corrida por 10 milhões de células.

Adicione as microesferas magnéticas do kit de isolamento CD4. 20 microlitros para cada tubo de 10 milhões de células e coloque no gelo por 15 minutos. Adicione 10 volumes do tampão de corrida para lavar e centrifugue a 230 × g durante 10 minutos.

Durante a centrifugação, prepare o ímã e o tubo de polipropileno de cinco mililitros na sua área de trabalho. Aspire o líquido do pellet celular. Adicione dois mililitros de tampão de corrida e remova os agregados utilizando uma pipeta de transferência.

Usando a mesma pipeta de transferência, transfira as células para o tubo de cinco mililitros e incube no ímã por 15 minutos. Decante cuidadosamente a fração de linfócitos T CD4 positivos para um tubo de 15 ml marcado, invertendo o ímã e esvaziando todo o conteúdo, exceto a última gota. Adicione mais dois mililitros de tampão de corrida ao tubo de cinco mililitros e remova-o do ímã.

Lave suavemente o CD quatro células negativas das paredes do tubo e transfira para um tubo de 15 ml marcado. Adicione dois mililitros de meio para linfócitos T a cada tubo. Remova alíquotas para contagem de células e centrifugue a 230 × g durante 10 minutos.

Dilua alíquotas celulares com azul de triano e conte utilizando um hemocitômetro. Essas contagens celulares determinarão o número de poços utilizados para o cultivo de expansão. Passo três.

Aspire o líquido do cultivo de expansão in vitro dos pellets celulares CD4 positivo e CD4 negativo com base na contagem de células. Adicione meio às células CD4 positivas para ajustar o volume a 3 milhões de células por mililitro. Adicione meio às células CD4 negativas para ajustar o volume a 10 milhões de células por mililitro.

A cultura de expansão requer 3 milhões de células CD4 negativas por poço e de dois a três milhões de células CD4 positivas por poço. Normalmente, as células CD4 positivas são a população limitante. Aliquotar as células CD4 negativas no número apropriado de poços em uma placa de 48 poços.

Adicionando 300 microlitros a cada poço, coloque a placa em um incubador a 37 graus por uma hora. Remova a placa do incubador, lave os poços adicionando 500 microlitros de meio fresco e pipetando suavemente para cima e para baixo de 12 a 20 vezes usando uma pipeta de transferência, removendo todo o líquido. Esta lavagem deixará uma camada de células apresentadoras de antígeno aderentes.

Quando a lavagem estiver concluída, adicione quantidade suficiente de meio apenas para umedecer o fundo de cada poço, aproximadamente 100 microlitros. Caso contrário, as células aderentes secarão. Adicione de dois a três milhões de células CD4 positivas a cada poço, se necessário.

Adicione meio adicional para completar o volume total em cada poço até um mililitro. Adicione o peptídeo desejado a cada poço. A concentração típica para estimulação é de 10 microgramas por mililitro.

Coloque a placa finalmente em uma incubadora a 37 graus por sete dias. Após sete dias, adicione 50 microlitros de hemo IL dois a cada poço em cada dia subsequente.

Monitore o crescimento celular utilizando um microscópio, alimentando poços que ainda não atingiram confluência, removendo metade do meio, adicionando meio fresco e 50 microlitros de IL; divida poços confluentes suspensando as células, transferindo metade das células para um poço vazio, adicionando meio fresco e 50 microlitros de IL, e retornando as células ao incubador. As células em expansão estarão prontas para coloração com teer após 13 a 15 dias de cultivo.

Passo quatro, visualização de linfócitos T por coloração com teter, adquira ou monte teters compatíveis com o peptídeo. Combinações de peptídeo-MHC utilizadas para estimular os linfócitos T positivos para CD4. Remova a placa do incubador.

Retire cuidadosamente metade do meio de cada poço. Transfira uma alíquota de células de cada poço, normalmente 75 microlitros ou cerca de 50.000 células, para um tubo de Fax de poliestireno de cinco mililitros, adicione teer normalmente um microlitro por 50 microlitros de volume total e coloque no incubador a 37 graus por uma hora. Também é recomendável corar uma segunda alíquota de cada poço com um teer incompatível como controle negativo, marcando as células com anticorpos anti-CD3, anti-CD4 e anti-CD25.

Podem ser utilizados marcadores de anticorpos adicionais ou alternativos. No entanto, não utilize anticorpos marcados com PE, pois este canal deve permanecer reservado para os teems no momento. Além disso, marque quaisquer controles de cor única ou de isotipo utilizando células extras.

Incube as células marcadas com anticorpo por 15 a 30 minutos a quatro graus. Lave cada tubo com 0,5 a um mililitro de tampão de corrida e centrifugue a 230 × g por 10 minutos. Remova cuidadosamente o líquido dos tubos, calibre o citômetro de fluxo utilizando esferas de referência, tubos controle de cor única, controles de isotipo e outros.

Analisar cada tubo utilizando o citômetro de fluxo. As células tetrapositivas devem formar uma população distinta entre as células T CD4 positivas expandidas. As células tetrapositivas geralmente são CD25 positivas e frequentemente CD4 altas.I.