Preparação padronizado de uma única célula Suspensões do tecido pulmonar do rato usando o Dissociator gentleMACS
2 de julho de 2009
Dissociar as células de tipos de tecido específico requer parâmetros específicos para a agitação do tecido para obter um volume elevado de viáveis, as células cultiváveis. A Miltenyi gentleMACS dissociator otimiza essa tarefa com um protocolo simples e prática. Nesta publicação o uso deste aparelho no tecido pulmonar é explicado.
Neste protocolo em vídeo, você verá como dissociar tecido pulmonar de camundongo adulto usando o gentle max após a dissociação do tecido pulmonar. Na presença de colagenase D e DNAse, suspensões celulares são filtradas utilizando uma peneira celular de 70 mícrons, centrifugadas e suspensas para aplicações posteriores. Olá, sou Melanie Mlu da Mil Biotech na Alemanha.
Hoje vou mostrar a vocês um procedimento reprodutível e automatizado para a preparação de uma suspensão de células únicas a partir de tecido pulmonar de camundongo utilizando a dissociação GenX. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para preparar suspensões de células únicas com o objetivo de obter leucócitos ou células endoteliais. Ok, vamos começar.
Antes de iniciarmos o protocolo, algumas soluções padrão devem ser preparadas e mantidas prontas. Primeiro, precisaremos do tampão Hebes. Segundo, uma solução de colagenase D contendo 100 miligramas por mililitro de enzima e tampão Hebes.
Terceiro, uma solução de dase um contendo 20.000 unidades por mililitro de dase um. Por fim, duas soluções tampão comuns. Um tampão PBS típico em pH 7,2 e um tampão PEB derivado da solução de lavagem AutoMax e da solução estoque de BSA.
Iniciamos nosso protocolo com um pulmão dissecado proveniente de um camundongo fêmea de biópsia com seis a sete semanas de idade. Certifique-se de que o pulmão esteja livre de órgãos adjacentes, como coração e timo, vasos sanguíneos eferentes e aferentes, traqueia e tecidos conjuntivos. Lave o tecido em uma placa de Petri contendo PBS para remover eritrócitos.
Normalmente, um pulmão de camundongo nesta idade pesa entre 110 e 150 miligramas. Se você planeja associar pulmões de animais mais velhos ou de outras linhagens de camundongos, pese o tecido e o tampão. Um máximo de 450 miligramas de tecido pode ser dissociado por tubo.
Transfira o tecido pulmonar para um tubo gentle max C contendo 4,9 mililitros de tampão heis. Adicione 100 microlitros de solução de colagenase D até uma concentração final de dois miligramas por mililitro ao tecido pulmonar e ao tampão. Agora, 10 microlitros de dase.
Uma solução para mais de 150 miligramas de tecido. Adicione 20 microlitros da solução de dase. Certifique-se de que o tubo C está bem fechado e coloque-o de cabeça para baixo no gentle max dis.
Certifique-se de que o tecido está localizado entre o rotor e o estator. Selecione o programa de pulmão e execute-o pressionando o botão de início; ao final do programa, remova o tubo C do instrumento e incube a amostra por 30 minutos.
Em uma incubadora a 37 graus Celsius durante a incubação, o tubo deve ser rotacionado usando o rotator de tubos max mix ou girado manualmente a cada cinco minutos. Após a incubação, retorne o tubo C ao max Associator suave e execute o segundo programa pulmonar. Enquanto o programa estiver em execução, prepare um tubo de 50 mililitros para coletar as células filtradas substituindo a tampa por um filtro celular de malha de 70 micrometros. Assim que o programa de dissociação terminar, dependendo da distribuição do material da amostra no tubo, você pode querer centrifugar brevemente o tubo para concentrar o material da amostra.
As células dissociadas podem ser removidas do tubo por pipetagem através da tampa com selo septado do tubo C. Utilizando uma ponteira adequada de pipeta de 1000 microlitros, a suspensão celular é aplicada no filtro celular para remover partículas maiores ou agregados. Após a solução ter drenado, lave o filtro celular adicionando mais cinco mililitros de tampão hees à temperatura ambiente para sedimentar as células filtradas.
Centrifugue o tubo de 50 mililitros a 300 ×g por 10 minutos. Em seguida, aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular no volume desejado de tampão PEB à temperatura ambiente.
Não decante o sobrenadante. Agora você pode prosseguir para sua aplicação posterior. A dissociação do tecido pulmonar de camundongo usando este procedimento resultará em uma alta porcentagem de leucócitos e células endoteliais viáveis.
As suspensões de células isoladas obtidas foram coradas com CD45 PE, CD146 FITC ou CD31 FITC e analisadas por citometria de fluxo. Este gráfico mostra o enriquecimento de células dendríticas utilizando microesferas magnéticas CD11c, um separador minimax e duas colunas MS. Ok. Acabei de mostrar como preparar suspensões de células isoladas a partir de tecido pulmonar de camundongo de maneira padronizada, utilizando a dissociação suave com tubos C.
Este método permite a dissociação eficiente do tecido gênico. Ao realizar este procedimento, é importante dissecar adequadamente o pulmão e processar o tecido imediatamente após a dissecação. As suspensões de células simples preparadas podem então ser utilizadas para experimentos posteriores.
Por exemplo, a marcação magnética das células e, em seguida, a separação de leucócitos ou células endoteliais. Ok, é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este protocolo em vídeo demonstra a dissociação de tecido pulmonar de camundongo adulto utilizando o dissociador gentleMACS. O procedimento foi projetado para produzir um grande volume de células viáveis e cultiváveis para aplicações posteriores.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Técnicas de dissociação celular
- Preparação de suspensão de células isoladas
- Análise de tecido pulmonar de camundongo
Contexto
- A dissociação de células a partir de tecidos requer parâmetros específicos.
- O dissociador gentleMACS fornece um protocolo otimizado.
- Colagenase D e DNase são utilizadas no processo de dissociação.
- Suspensões celulares filtradas são preparadas para aplicações posteriores.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar um método reprodutível para o preparo de suspensões de células isoladas.
- Facilitar o estudo de leucócitos e células endoteliais.
- Fornecer um protocolo prático para pesquisadores da área.
Métodos Utilizados
- Uso do dissociador gentleMACS para agitação do tecido.
- Aplicação de colagenase D e DNase durante a dissociação.
- Filtração das suspensões celulares por meio de um filtro celular de 70 mícrons.
- Centrifugação e suspensão das células para aplicações posteriores.
Resultados Principais
- Dissociação bem-sucedida de tecido pulmonar de camundongo em suspensões de células isoladas.
- Obtenção de alto volume de células viáveis e capazes de ser cultivadas.
- O protocolo demonstrou reprodutibilidade e eficiência.
- Preparação adequada para aplicações posteriores.
Conclusões
- O dissociador gentleMACS é eficaz para a dissociação de tecido pulmonar.
- Este método pode ser aplicado a diversos tipos de tecidos.
- Fornece uma ferramenta valiosa para pesquisadores que estudam tecido pulmonar.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A dissociação padronizada de tecidos é uma etapa crítica e inicial na pesquisa em imunologia e biologia vascular, permitindo a preparação reprodutível de suspensões primárias de células para análises posteriores. O Dissociador gentleMACS fornece um método automatizado, suave e escalonável para gerar suspensões de células únicas com alta viabilidade a partir de tecido pulmonar de camundongo, oferecendo uma entrada consistente para citometria de fluxo, separação celular e perfilagem molecular. Essa capacidade aumenta a confiança preditiva em estudos de validação de alvos ao reduzir a variabilidade no rendimento celular e na viabilidade entre experimentos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a análise de populações de leucócitos e células endoteliais no tecido pulmonar para testes de hipóteses específicas.
- Valor Operacional: Reduz a variabilidade manual no processamento de tecidos, melhorando a reprodutibilidade entre laboratórios e pontos temporais.
- Valor Preditivo: Garante entrada celular consistente para citometria de fluxo e separação celular, aumentando a confiabilidade dos resultados de triagem fenotípica.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Produz suspensões filtradas e livres de detritos, adequadas para marcação com anticorpos e ensaios baseados em fluxo.
- Valor Operacional: A digestão enzimática padronizada e a dissociação mecânica garantem consistência entre lotes em relação ao rendimento celular.
- Prontidão para Ensaios: Gera suspensões compatíveis com aplicações posteriores, como marcação magnética e separação de células.
Pesquisa Translacional e Pré-Clinica
- Continuidade Translacional: Fornece um sistema relevante para a doença no estudo da dinâmica de células imunes e vasculares no tecido pulmonar.
- Suporte a Modelos Pré-clínicos: Permite o isolamento de células primárias de pulmões murinos para desvendar mecanisticamente alvos terapêuticos com menor risco.
- Avanço com Base no Risco: O preparo confiável de células sustenta análises consistentes de biomarcadores e validação funcional em fluxos de trabalho pré-clínicos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O Dissociador gentleMACS se insere no fluxo de trabalho de descoberta como uma etapa padronizada de preparação de amostras entre a coleta do tecido e a análise celular, permitindo uma transição confiável de tecido ex vivo para células únicas prontas para ensaios.
- Biologia da Descoberta: Apoia o isolamento orientado por hipóteses de células imunes e estromais residentes no pulmão para análise de vias metabólicas.
- Triagem: Fornece suspensões celulares reprodutíveis para triagem fenotípica de alto conteúdo ou baseada em fluxo de moduladores imunológicos.
- Análises: Permite leituras quantitativas por citometria de fluxo (por exemplo, CD45+, CD31+) para comparação de condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta modelos murinos de pulmão a estudos de células imunes e endoteliais relevantes para humanos por meio de preparação padronizada.
- Reutilização Empresarial: O protocolo pulmonar pré-programado do instrumento permite reutilização em diversos projetos que estudam inflamação pulmonar, fibrose ou infecção.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Alta viabilidade e pureza de leucócitos e células endoteliais aumentam a qualidade dos dados em aplicações subsequentes.
- Valor Operacional: A automação reduz o tempo de manipulação manual e a variabilidade dependente do usuário na dissociação do tecido.
- Valor Estratégico: Permite decisões de prosseguimento ou interrupção com base em rendimentos celulares e métricas de viabilidade consistentes.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos ao fornecer insumos confiáveis de células primárias para validação.
Considerações sobre a Implementação
- Exige treinamento em dissecação asséptica de tecidos e manipulação enzimática.
- Depende do acesso ao Dissociador gentleMACS com programa específico para pulmão e tubos C.
- Necessita padronização das concentrações de enzimas (Colagenase D, DNase) e condições de tampão entre diferentes usuários.
- Pode ser necessária adaptação para diferentes linhagens de camundongos, idades ou modelos de doença que afetem a densidade do tecido.
- Limita-se a tecidos compatíveis com dissociação enzimática; podem ser necessárias alternativas mecânicas para amostras fibrosas ou calcificadas.
