Produção lentivírus

Este procedimento começa com a transdução de células 293T com lentivírus, plasmídeo e vetores de empacotamento viral; o sobrenadante viral é coletado após um período de incubação de pelo menos 48 horas. O sobrenadante é filtrado e concentrado por ultracentrifugação. O pellet viral é ressuspenso em PBS para obtenção do título viral: primeiramente, dilua o vírus concentrado em meio completo e, em seguida, realize diluições seriadas para infectar as células com lentivírus.

Olá, sou Shein Wong do laboratório de Michael McManus no Centro de Diabetes da Universidade da Califórnia em São Francisco. Sou Michael McManus. Hoje vamos mostrar um procedimento para a produção de lentivírus.

Utilizamos este procedimento no laboratório para produzir lentivírus para interferência de RNA. Vamos começar. Para iniciar este protocolo, prepare o DNA que será usado para transfectar as células 2 9 3 T.

Primeiro, dilua o reagente de transfeção FU gene seis em um tubo de 1,5 mililitro misturando 30 microlitros de Fuji seis com 600 microlitros de meio sem soro. Tenha cuidado para não deixar o Fuji tocar nas paredes do tubo ao adicioná-lo ao meio e incube à temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, na tampa do tubo, misture quatro microgramas do plasmídeo lentiviral com 1,33 microgramas.

Cada vetor de empacotamento viral de terceira geração. O plasmídeo lentiviral contém o DNA. O vírus será inserido no genoma de todas as células que infectar, enquanto os vetores de empacotamento contêm os genes para todas as outras proteínas necessárias para produzir um vírus lentiviral; feche a tampa e misture invertendo o tubo algumas vezes.

Incube o DNA e o reagente de transfeção por 15 a 20 minutos à temperatura ambiente. Agora é a hora de transfectar as células 2 9 3 com o DNA que você preparou: use células que foram semeadas 24 horas antes e que atingiram 50 a 70% de confluência. Na capela de cultura de tecidos, pipete todo o DNA preparado sobre a placa de células 2 9 3 e misture suavemente inclinando a placa para frente e para trás. Retorne as células ao incubador e permita que a produção viral prossiga por 48 a 96 horas antes da colheita. Durante a incubação, as células 2 9 3 produzem lentivírus cujos genomas contêm uma cópia de RNA do seu DNA de interesse.

Agora é a hora de coletar o vírus. Retire suas células do incubador. Tenha prontos na capela de cultura de tecidos um filtro de seringa de 0,4 ou cinco mícrons, uma seringa descartável de 10 mililitros e um tubo de centrífuga UltraClear Beckman.

Use a seringa descartável para remover o sobrenatante, que agora contém o vírus. Acople um filtro de seringa de 0,45 mícron à ponta e filtre o vírus para dentro de um tubo de centrífuga UltraClear Beckman. O filtro permite a passagem apenas de vírus, não de células, e antes de descartar, incube todas as células produtoras de vírus.

Coloque placas de cultura, seringas e filtros em água sanitária a 10% por 45 minutos. Agora que você coletou e filtrou o vírus, é hora de concentrá-lo por ultracentrifugação. Use DMEM sem soro para equilibrar todos os tubos contendo vírus, deixando-os com diferença máxima de 0,2 gramas entre si.

Em seguida, carregue os tubos de centrífuga balanceados nos baldes do rotor SW 41 TI ou SW 28. Feche hermeticamente os baldes do rotor e prenda-os ao rotor. Em seguida, coloque o rotor dentro da ultracentrífuga.

Centrifugue o vírus por cerca de 90 minutos a quatro graus Celsius a 25.000 RPM em um rotor SW 41 TI, ou a 24.000 RPM em um rotor SW 28. Após a centrifugação, retorne à capela de cultura de tecidos e inverta o tubo para derramar o SNAT em um recipiente contendo água sanitária a 10%. Use uma toalha de papel Kim para absorver o líquido em excesso ao redor do pellet e inverta o tubo em um suporte conveniente por não mais de cinco minutos, até que você esteja pronto para ressuspender o pellet.

Para ressuspender o pellet viral, use uma ponteira de filtro para adicionar 100 microlitros de PBS estéril pré-filtrado ao seu tubo. Em seguida, pipete para cima e para baixo cerca de 20 vezes. Deixe o vírus a quatro graus durante a noite para completar a ressuspensão.

Você pode armazenar preparações virais a quatro graus por cerca de uma semana e a menos 80 graus por até um ano. Lembre-se de tratar todos os tubos vazios com água sanitária a 10% antes de descartá-los. Se você pretende usar a preparação viral por mais de uma semana, ela pode ser mantida na geladeira.

Prepare alíquotas mínimas de cinco a 20 microlitros para experimentos futuros e uma alíquota de três a cinco microlitros para a titulação, congele e armazene as alíquotas a aproximadamente menos 80. O próximo passo é determinar o título viral. Se você incluiu um gene repórter fluorescente no seu plasmídeo lentiviral, as células infectadas fluorescerão e você poderá determinar o título viral utilizando citometria de fluxo.

Para começar, dilua três microlitros de vírus concentrado em 1,5 mililitro de meio completo em poços de um a seis, em uma única fileira de uma placa de 96 poços. Realize as seguintes diluições seriadas em todos os seis poços com 100 microlitros de DM completo. Ao primeiro poço, adicione 100 microlitros de meio sem vírus.

Este é o seu controle não corado. Ao segundo poço, adicione 100 microlitros do vírus diluído ao terceiro. Adicione 100 microlitros da mistura do segundo poço ao quarto.

Adicionaremos 100 microlitros do terceiro poço ao quinto. Adicionaremos 100 microlitros do quarto poço ao sexto. Adicionaremos 100 microlitros do quinto.

Por fim, retire 100 microlitros do sexto poço e descarte, depois adicione solução de hipoclorito para ajustar o volume total em todos os poços a 200 microlitros com DMEM. A cada diluição, a concentração viral diminui pela metade. Observe que essas são apenas diluições sugeridas, que devem funcionar bem para a titulação da maioria dos vírus concentrados.

Se o seu vírus tiver título baixo ou estiver não concentrado, você poderá precisar ajustar suas diluições. Trate qualquer vírus diluído não utilizado com água sanitária a 10% durante 45 minutos antes de descartá-lo em um recipiente para resíduos biológicos. Adicione cerca de 15.000 células 293T saudáveis e em divisão ativa a cada um dos seis poços.

Você pode usar uma única placa de 96 poços para titular 16 preparações virais, completar os poços até 200 microlitros, retornar as células ao incubador e permitir que a infecção prossiga por pelo menos 48 horas. Após a incubação, analise a fluorescência celular utilizando um citômetro de fluxo. Você pode usar a porcentagem de células fluorescentes por poço para determinar a titulação ou o número de partículas virais infecciosas por mililitro de vírus adicionado.

Calcule o número de unidades infecciosas por mililitro com a seguinte fórmula ao interpretar os resultados do citômetro de fluxo. Observe que é possível obter cálculos precisos de título apenas quando as células infectadas receberam não mais do que uma integração viral por célula.

Para garantir que esse seja o caso, utilize células com taxa de infecção inferior a 15% para os cálculos. Células com taxas de infecção mais altas provavelmente terão recebido múltiplas integrações virais por célula. A diluição sugerida na etapa dois deve produzir várias amostras dentro dessa faixa de infecção.

Use idealmente várias amostras para gerar um gráfico de titulação a partir do qual é possível calcular o título final. A fórmula calculada a partir da reta linear ajustada pode ser utilizada para determinar o título viral, mas é possível calcular o título usando uma única amostra, se necessário. Pode-se esperar um título de um vezes 10 à sétima unidades transdutoras por mililitro para vírus não concentrado, e um vezes 10 à oitava unidades transdutoras por mililitro para vírus concentrado.

Acabamos de mostrar como produzir lentivírus ao realizar este procedimento. É importante seguir todas as regulamentações de biossegurança e descartar os resíduos adequadamente. Assim sendo, é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.