Embalagem HIV-FIV ou à base de construções de expressão e Lentivector Transdução de Partículas Pseudotyped VSV-G virais

O objetivo geral deste procedimento é aprender sobre o empacotamento de lentivírus. Um protocolo de cinco dias. No primeiro dia, as células produtoras 293TN são semeadas em uma densidade calculada.

No segundo dia, as células são transfectadas com o construto do vetor lenti de escolha, contendo o gene de interesse, e com a mistura de plasmídeos de empacotamento viral. No quarto dia, o sobrenadante viral é coletado e concentrado pela adição da solução de precipitação viral com PEG. Os passos finais do procedimento consistem em colher o vírus concentrado com PEG, alíquotar o vírus e infectar células com o vírus concentrado para titulação viral.

Por fim, a PCR quantitativa de genes estavelmente integrados é utilizada para calcular o número de construtos integrados de forma estável. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como transfeção plasmidial ou transdução retroviral, é que o protocolo otimizado de empacotamento de lentivírus do FBI produz vírus funcionalmente ativos com alto título, o que permite uma entrega eficiente em quase qualquer célula de mamífero, incluindo células difíceis de transfectar, como células-tronco e células primárias não divididas. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica enfrentam dificuldades porque não estão familiarizados com os pequenos detalhes do protocolo, que são essenciais para a produção bem-sucedida de vírus com alto título.

A demonstração visual deste método é útil, pois a densidade celular visualizada ao microscópio durante a transfeção determina a eficiência do empacotamento viral, o que por sua vez determina o título viral final. Em casos nos quais a expressão de um repórter fluorescente aplicável determina a eficiência da transfeção, isso tem um impacto significativo no título viral final. Além disso, a demonstração visual deste método auxilia os pesquisadores a se familiarizarem com partes sutis, porém importantes, do protocolo, como as melhores práticas para manter a esterilidade durante todo o processo e como evitar incluir detritos celulares no vírus colhido.

O empacotamento eficiente de lentivírus depende de três componentes. Primeiro, o vetor de expressão lentiviral deve conter alguns dos elementos necessários para o empacotamento do vírus e integração estável, bem como elementos para a expressão do gene de interesse, como um cabelo curto, RNA, microRNA ou um cassete repórter.

Em segundo lugar, os plasmídeos de empacotamento lentiviral devem fornecer as proteínas essenciais para o empacotamento de uma cópia de RNA do construto de expressão em partículas virais pseudotípicas recombinantes e para a transcrição reversa subsequente e integração viral após infecção. Em terceiro lugar, as células produtoras 293TN devem ser cotransfectadas temporariamente com os vetores de expressão e de empacotamento. Essas células produzem partículas virais pseudotípicas em altos títulos, que podem ser coletadas do meio de cultura.

No fim das contas, a transdução bem-sucedida das células-alvo depende principalmente do número de partículas virais por célula para um determinado tipo celular. Em outras palavras, a multiplicidade de infecção começa cultivando células 293TN em placas de cultura celular de 15 centímetros por 18 a 24 horas para obter uma confluência de 60 a 80%.

No momento da transfeção, cada placa renderá aproximadamente 14 milhões de células para aumentar o rendimento do vírus. Mais de uma placa pode ser usada no dia seguinte, quando as células 2 9 3 TN estiverem com 60 a 80% de confluência, estando prontas para transfeção. Para cada placa de células, adicione 1,6 mililitros de DMEM sem soro a um tubo cônico de 15 mililitros.

Em seguida, adicione 22,5 microgramas de ppac H um ou Ppac F1 e 4,5 microgramas do seu vetor lenti Construto ao DMEM e misture pipetando para cima e para baixo. A seguir, adicione 55 microlitros de pure affection ao mesmo tubo e vortexie por 10 segundos, seguido por uma incubação de 15 minutos à temperatura ambiente. Após 15 minutos, adicione um tubo a cada placa de cultura.

Adicione gota a gota e gire suavemente a placa, depois incube as células por 48 horas a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono após 48 horas. Se o vetor lentiviral expressar um gene fluorescente como GFP, examine as células ao microscópio; uma transfeção bem-sucedida resultará em 50 a mais de 90% das células verdes fluorescentes. Agora, colete o sobrenadante do cultivo celular em um tubo cônico de 50 mililitros. O sobrenadante contém as partículas pseudovirais infecciosas.

Quaisquer células destacadas da placa não afetarão negativamente a produção do vírus. Para remover os detritos, centrifugue o sobrenatante viral a 1500 G durante 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, sem perturbar o pellet, colete o sobrenatante viral, certificando-se de deixar um volume tampão de cerca de 500 microlitros de sobrenatante, e prossiga para a próxima etapa, que consiste em concentrar as partículas virais 72 horas após a transfeção.

Uma segunda coleta opcional do sobrenatante viral pode ser realizada usando a mesma técnica após a coleta do estado viral. Concentre adicionando um volume de solução de precipitação de vírus com PEG gelado a cada quatro volumes de sobrenatante em um tubo de centrífuga de polipropileno de 50 mililitros. Inverta a solução para misturá-la.

Nunca utilize um vórtex e, em seguida, armazene a solução sem agitação a quatro graus Celsius por até 96 horas. Após um mínimo de 12 horas de refrigeração, centrifugue a mistura a 1500 ×g por 30 minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, as partículas lentivirais precipitadas com peggo aparecerão como um precipitado bege ou branco no fundo do tubo.

Agora, remova todos os vestígios de fluido por aspiração cuidadosa, sem perturbar as partículas lentivirais precipitadas no pellet. Alternativamente, remova a maior parte do sobrenadante e ressuspenda o pellet no sobrenadante remanescente. Em seguida, transfira a suspensão para um tubo eppendorf estéril de dois mililitros e centrifugue o tubo em uma microcentrífuga fria por dois minutos.

A 14.000 RPM, pipete o sobrenatante remanescente e re-suspenda o pellet de partículas lentivirais em gelo, em tampão estéril e frio, em um volume entre um décimo e um centésimo do volume original. Pipete cuidadosamente o pellet para a solução sem formar bolhas, mantendo-o sempre frio. Certifique-se de que o pellet foi completamente re-suspenso.

Por fim, faça alíquotas de 15 a 25 microlitros da tinta em frascos criogênicos estéreis sobre gelo e armazene os frascos a menos 70 graus Celsius. Um ensaio de embalagem bem-sucedido produzirá de 10 milhões a 1000 milhões de UI por mililitro para transdução viral em uma placa de cultura de 24 poços, com 50.000 células por poço, e cultive-as durante a noite nas condições de cultura especificadas. As células devem apresentar confluência entre 50 a 70% para a transdução com fins de titulação.

Células HT 10 80 podem ser usadas como uma linhagem celular controle de fácil transdução; no dia seguinte, aspire o meio das células. Em seguida, combine o meio de cultura com a solução concentrada de transdução. Assim, a concentração final de transdução é de um x; adicione meio mililitro da solução transduzida a cada poço com células-alvo na densidade correta de 50 a 70% de confluência. Adicione o vírus a cada poço nas seguintes diluições: um para 100, um para 10 e diluição direta um para um.

O vírus pode permanecer em contato com as células-alvo por até 72 horas sem trocar o meio. Após 72 horas, o próvirus terá integrado de forma estável ao genoma do hospedeiro e estará expressando o gene de interesse. Se houver expressão de marcador fluorescente, ela poderá ser utilizada para estimar a eficiência de transdução com diferentes diluições do vírus; em seguida, o número de unidades infecciosas pode ser quantificado por QPCR.

Uma vez conhecido o título viral, calcule o volume apropriado de vírus para atingir a multiplicidade de infecção desejada para outras células-alvo. A medição do título e o controle da MOI garantem a consistência entre experimentos e diferentes preparações virais. O vírus está agora pronto para ser utilizado em experimentos adicionais.

A densidade inicial das células 2 9 3 TN foi crítica para o empacotamento viral bem-sucedido no dia da transfeção. Essas células 2 9 3 TN estavam entre 60 e 80% confluentes. Vinte e quatro horas após uma transfeção bem-sucedida com um vetor lentiviral que expressa GFP, verificou-se que pelo menos 90% das células 2 9 3 TN exibiam fluorescência verde.

72 horas após a transdução, a GFP continuou a ser expressa nas células hospedeiras HT 10 80. Isso indica que o construto lentiviral integrou-se de forma estável ao genoma do hospedeiro, e a transdução das mesmas células hospedeiras em uma diluição dez vezes menor reduziu proporcionalmente a expressão de GFP. Porque a relação entre título viral e expressão gênica mediada por lentivírus é diretamente proporcional.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada ao longo de cinco dias, com cerca de uma a duas horas por dia, se for executada corretamente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como embalar partículas virais infecciosas funcionalmente de maneira eficiente e segura, além de transduzir células com o vírus com sucesso. Não se esqueça de que trabalhar com lentivírus pode ser perigoso e de que precauções, como trabalhar em uma capela de cultura de tecidos BSL 2, devem ser tomadas.

Usar jaleco e luvas deve sempre ser adotado ao realizar este procedimento.