Mesoscópica de fluorescência para Tomografia In-vivo Imaging de desenvolvimento Drosophila

Para realizar as reconstruções de órgãos em desenvolvimento dentro do Drosophila melanogaster, precisamos determinar o modelo direto que melhor descreve a propagação da luz dentro da pupa propriamente dita. O procedimento começa com a seleção de uma pré-pupa branca e sua fixação na extremidade de um tubo capilar, de modo que o eixo ântero-posterior da pupa esteja orientado paralelamente ao tubo. Um pequeno tubo capilar é preenchido com um corante fluorescente e inserido no interior do casulo da pupa.

Após um cuidadoso ajuste dos eixos, a pupa é girada 360 graus. As imagens são adquiridas em diferentes ângulos. Os dados de transiluminação fluorescente adquiridos são utilizados para determinar o modelo direto que será usado para imagens do desenvolvimento de órgãos.

Olá, meu nome é Claudia e estou no Centro de Biologia Assistencial do Hospital Geral de Massachusetts, Escola Médica de Harvard. Sou Ula Petou do Laboratório Paramount da Escola Médica de Harvard, e sou Daniel Rozanski do Instituto de Imagem Biológica e Médica da Universidade Técnica de Munique e do Centro Heliman Munique. Hoje vamos mostrar um procedimento para reconstrução tridimensional de todo o corpo em Oph Melano Casta.

Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para a visualização in vivo do desenvolvimento de órgãos durante o estado pupilar. Então, vamos começar. Antes de iniciar, observe que não há um vídeo complementar que deve ser visualizado anteriormente a este, no qual alguns aspectos técnicos da tomografia por projeção óptica são explicados com maior detalhe do que aqui.

Além disso, o outro vídeo explica a obtenção de imagens de tecidos ou órgãos preparados de animais maiores. Para todos os experimentos abordados neste vídeo, serão utilizados transgenes de drosófila. Eles são o EL A gal quatro expresso nas glândulas salivares, o apteris gal quatro, que é expresso nos tecidos precursoras larvais da asa e do tórax adultos, e o transgene que produz a proteína fluorescente.

Em resposta à gal quatro chamada U-A-S-G-F-P e branco 1118, os machos de controle não fluorescentes portadores dos transgenes UAS são cruzados com fêmeas virgens portadoras dos transgenes GAL quatro para obter tecido. A expressão específica de GFP é estabelecida a partir de oito a dez fêmeas virgens e machos em meio padrão para moscas com uma pitada de levedura de padaria. Na superfície, os frascos são mantidos a 25 graus Celsius em um incubador umidificado sob um ciclo claro-escuro de 12 horas.

Dois dias após a iniciativa do cruzamento, os pais são transferidos para um novo frasco e, cinco a seis dias depois, os PUI começarão a povoar o frasco com PrepU. Os indivíduos são selecionados pela expressão de GFP em um microscópio estereoscópico fluorescente. A seleção de pré-PUI brancos garante o estadiamento adequado dos animais, já que eles permanecem brancos por cerca de uma hora.

Após a dilatação da pupila, eles então se tornam pigmentados ou acastanhados. Os pui expressando GFP são cuidadosamente coletados dos frascos usando um pincel úmido e colocados em uma gota de água ou PBS em uma placa de Petri, mas devem ser limpos de materiais autofluorescentes. Usando o pincel, eles agora devem estar prontos para a imagem tomográfica.

Se os PrepU precisarem continuar envelhecendo para atingir o estágio de desenvolvimento correto, eles podem ser mantidos em uma placa de Petri com uma toalha de papel úmida ou em um frasco de alimento limpo. Isso garantirá umidade suficiente e desenvolvimento adequado para a obtenção de imagens. Os PrepU devem ser aderidos ao interior de um tubo capilar de vidro com diâmetro de 800 mícrons.

Pinte a extremidade posterior da pupa com cola instantânea e oriente a superfície colada da pré-pupa para dentro do tubo, de modo que o eixo anterior-posterior da mosca fique paralelo ao tubo. A parte anterior do animal ficará projetada além do tubo capilar. O tubo capilar agora está fixado na platina rotacional do microscópio.

Na posição vertical, ajuste o eixo de inclinação do estágio rotacional de modo que o eixo de rotação do tubo fique paralelo às colunas de pixels do CCD de imagem. Com a posição da mosca ajustada, prossiga com a aquisição da imagem. Neste exemplo, animais com glândulas salivares fluorescentes devem ser imageados para que os que expressam GFP em suas glândulas salivares possam ser gerados a partir de um cruzamento entre linhagens EAG four e U-A-S-G-F-P.

Iniciamos com uma pré-pupa montada, iluminando a pré-pupa com um feixe de excitação e coletando o sinal fluorescente da GFP. Na transiluminação, gire o PrepU 360 graus ao longo de seu eixo vertical e adquira as imagens de transiluminação. Cada imagem corresponde a 10 graus de rotação.

O tempo total de aquisição depende da quantidade de fluorescência e da intensidade do feixe de excitação. Os tempos típicos são da ordem de um minuto. Neste exemplo, uma pupa de DSO que expressa GFP nos discos imaginais das asas será analisada.

Esta pupa pode ser coletada de um frasco contendo um cruzamento entre as linhagens Aus GAL quatro e U-A-S-G-F-P. A pré-pupa é montada conforme descrito anteriormente. No entanto, como o tempo de imageamento para este experimento é de cerca de oito horas, é fundamental que o ambiente permaneça úmido e em temperatura ambiente para evitar a desidratação e a morte do animal. Uma obturadora é colocada sobre o feixe de excitação para evitar o quenching dos florais quatro no tecido de interesse, bem como para garantir que o animal não seja queimado pelo feixe a laser; como antes, ilumine com o feixe de excitação e colete o sinal fluorescente de GFP por transiluminação.

A pré-pupa é completamente girada ao longo de seu eixo vertical. Durante a coleta de dados, a rotação leva apenas um minuto e é repetida em diferentes intervalos de tempo. Para criar uma série de imagens em lapso de tempo das asas durante o desenvolvimento, os dados podem ser adquiridos por pelo menos seis horas a uma taxa de 100 imagens por hora.

É fundamental que a exposição total à luz seja controlada com este obturador, a fim de evitar danos ou fotobranqueamento. Este filme mostra imagens adquiridas entre a fase PrepU e a aversão da cabeça à pupila. Ao reconstruir a imagem tridimensional, há um forte espalhamento para frente que precisa ser considerado, o qual não pode ser aproximado pela difusão.

Para realizar a reconstrução, um modelo de espalhamento direto da propagação da luz deve ser determinado. Por simplicidade, desprezamos a absorção. A quantidade de espalhamento é testada experimentalmente. Para isso, um objeto estranho com fluorescência padronizada é inserido na pré-pupa branca não fluorescente 1118, que é então escaneada para gerar os dados do modelo direto. Comece preenchendo um tubo capilar de sílica de 100 mícrons com corante fluorescente PS 5,5.

Usando a ação capilar, insira o tubo capilar na pupa em um ângulo de 45 graus em relação ao eixo anterior, monte o PrepU em um tubo capilar e posicione-o adequadamente sobre a platina rotativa conforme descrito anteriormente. Agora, ilumine a pré-pupa com um feixe a laser de excitação utilizando uma lente de baixa abertura numérica e colete imagens fluorescentes de transiluminação da pré-pupa. Conforme descrito anteriormente, o software MATLAB é utilizado para ajustar os dados ao modelo teórico explícito direto. Para facilitar o processo de reconstrução, a aproximação firme-e à equação de transporte é selecionada, pois descreve o regime de espalhamento direto e também se ajusta aos dados experimentais.

Após determinar o modelo direto correto, podemos reconstruir as glândulas salivares e obter reconstruções tomográficas com lapso de tempo. Se você pretende utilizar uma tomografia em espaço livre, os algoritmos de configuração para casamento de índice também podem ser ajustados. Primeiro, mostramos uma reconstrução tridimensional das glândulas salivares no início do desenvolvimento.

Para comparação, a coloração histológica das glândulas salivares mostra que as reconstruções se correlacionam bem com a histologia. Este filme com lapso de tempo do desenvolvimento dos discos imaginais das asas foi obtido a partir de um único espécime vivo. Para comparação, a coloração histológica do disco da asa nos mesmos pontos temporais mostra que as reconstruções se correlacionam bem com a histologia.

Acabamos de mostrar como montar um sistema para obter imagens de estruturas tridimensionais dentro de oph in vivo e ao longo do tempo. Isso nos permite acompanhar a morfogênese em Drosophila e observar o desenvolvimento das asas durante seis horas consecutivas. Ao realizar este procedimento, é fundamental escolher o modelo direto correto para a propagação da luz dentro de Drosophila.

Este método pode ser usado em combinação com técnicas histológicas para esclarecer o desenvolvimento de órgãos durante as fases oculares, e pode ser modificado para o estudo de diferentes organismos de tamanho semelhante. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.