Replicação de DNA visualizar Único molécula com microscopia de fluorescência

Nesta técnica, lamínulas de vidro são funcionalizadas com uma mistura de moléculas de PEG inertas e biotiniladas. Uma câmara de fluxo é criada com essa superfície funcionalizada e colocada sobre um microscópio TIRF. Modelos circulares biotinilados são ligados à superfície utilizando estreptavidina multivalente.

Quando os substratos são replicados pela adição de proteínas da zona de replicação e nucleotídeos, o DNA de dupla fita resultante é alongado por fluxo laminar e visualizado em tempo real usando um corante intercalante. Olá, sou Nathan Tanner do laboratório de Antoine Van Ian, do Departamento de Bioquímica Biológica e Farmacologia Molecular da Escola Médica de Harvard. Sou Joe Laro, também do laboratório Van Noian.

Hoje vamos mostrar um procedimento para imagem de fluorescência da replicação do DNA em tempo real no nível de única molécula. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar as atividades coordenadas de síntese de DNA em complexos de replicação individuais. Então, vamos começar.

Para iniciar este procedimento, hibridize o oligo com cauda biotinilada ao DNA simples fita M13 adicionando um excesso de dez vezes do oligo em tampão TBS, aquecendo a 65 graus Celsius e, em seguida, desligando o bloco térmico para permitir o resfriamento lento e a adequada hibridização do iniciador. Agora que o iniciador M13 está pronto, adicione-o a uma mistura contendo 64 nanomolares da polimerase T7 e tampão de replicação T7 contendo dNDPs e cloreto de magnésio, e incube a reação a 37 graus Celsius por 12 minutos. Ao final da incubação, interrompa a reação com EDTA 100 milimolar.

A seguir, purifique o DNA do produto preenchido com fenol, álcool isoamilico e clorofórmio, realize extração e diализação em tampão TE ou outro tampão de armazenamento adequado, e refaça a extração de cada fase orgânica para recuperar qualquer primer residual. Após a diálise, determine a concentração de DNA com espectrofotômetro UV-vis. Uma iteração do preparo do molde pode gerar concentração nanomolar suficiente de molde para centenas a milhares de experimentos de molécula única.

Agora que o DNA está pronto, prossiga para o preparo das lamínulas funcionalizadas. O DNA a ser replicado é ligado a lamínulas de vidro funcionalizadas com Amil Lane, no qual o grupo Oxi do Amil se liga ao vidro, deixando um amina disponível para ligar moléculas de peg biotiniladas. Este revestimento ajuda a reduzir a ligação não específica à superfície.

Para limpar completamente as lamínulas de vidro, coloque-as em frascos de coloração e encha os frascos com etanol submetido à sonicção. Enxágue os frascos por 30 minutos, encha com hidróxido de potássio 1 M, submeta à sonicção por 30 minutos e repita ambas as lavagens. Para a primeira reação de funcionalização, é necessário remover todos os vestígios de água.

Encha os frascos de coloração com acetona e sonique por 10 minutos. Esvazie os frascos e encha novamente com acetona. Prossiga adicionando o reagente sine aos frascos e agite por dois minutos.

Em seguida, interrompa a reação com um grande excesso de água. Depois, seque as lamínulas aquecendo-as a 110 graus Celsius em estufa por 30 minutos. A seguir, prepare a mistura de PEG a aproximadamente 0,2% peso por volume com PEG aminado, incluindo um espaçador de lamínula de vidro que permitirá a separação das lamínulas; pipete 100 microlitros sobre uma lamínula seca silanizada.

Coloque um segundo lamínula por cima. Incube os lamínulas na solução de PEG por três horas. Em seguida, separe cada par de lamínulas e lave abundantemente com água.

Tenha cuidado para manter os lâminas com o lado funcionalizado voltado para cima, pois apenas um lado será revestido com peg. Por fim, seque os lâminas com ar comprimido e armazene-os sob vácuo em um dessecador; as superfícies permanecem estáveis por pelo menos um mês. Assim, dezenas de lâminas podem ser produzidas em um único lote e utilizadas conforme necessário.

Agora que as lamínulas estão prontas, pode-se montar a câmara de fluxo para o experimento de molécula única. Comece colocando de 20 a 25 mililitros de tampão bloqueador contendo BSA em um dessecador para remover quaisquer bolhas de ar em etapas posteriores. Em seguida, dilua 25 microlitros de estreptavidina em 100 microlitros de PBS e espalhe a solução sobre a superfície de uma lamínula funcionalizada com pinos; incube por 20 minutos à temperatura ambiente para permitir que a estreptavidina se ligue à biotina da superfície, enquanto prepara as outras partes da câmara.

Enquanto a lamínula está em incubação, corte um pedaço de fita adesiva dupla face com revestimento em ambos os lados, de modo que corresponda ao tamanho da lâmina de quartzo utilizada para montar a câmara de fluxo. Marque a posição dos orifícios para os tubos na fita com um lápis, de forma que um contorno da câmara de fluxo possa ser desenhado sobre a fita. Após marcar os orifícios, faça um retângulo de dois milímetros de largura ao redor das marcações.

Este retângulo servirá como canal de fluxo, portanto, certifique-se de fazer lados retos e deixar espaço ao redor da entrada e saída da tubulação. Agora corte a fita marcada ao longo do contorno desenhado, fazendo cortes retos e limpos para garantir que nenhum adesivo se projete para dentro do canal. Limpe a lâmina de quartzo completamente usando acetona para remover o adesivo da construção da célula de fluxo utilizada em experimentos anteriores.

Encontre o melhor alinhamento do contorno do canal. Remova um lado do revestimento adesivo e coloque cuidadosamente a fita sobre a lâmina da câmara. Tenha cuidado para alinhar corretamente a fita, pois os orifícios de entrada e saída precisam permanecer desobstruídos.

Em seguida, prepare os comprimentos cortados de tubo de 0,76 milímetro para a entrada e saída da célula de fluxo. É útil cortar a extremidade do tubo em um ângulo de aproximadamente 30 graus para que o tubo não fique pressionado contra o fundo da câmara. Suspenda os tubos em suportes para tubos de ensaio para facilitar a ligação à célula de fluxo nas próximas etapas.

Neste momento, a incubação da lamínula já foi concluída. Enxágue bem a lamínula revestida com strep avid ENC com água e seque utilizando ar comprimido. Tenha cuidado para não virar a lamínula, pois apenas um dos lados está funcionalizado.

Por fim, conclua a montagem da câmara de fluxo removendo o outro lado da fita adesiva e colocando a lâmina de quartzo sobre a lamínula. Pressione levemente a lamínula para expelir qualquer ar aprisionado no adesivo. Isso ajudará a prevenir a formação de bolhas de ar no canal de fluxo.

Selar os lados da câmara com epóxi. Inserir o tubo cortado nos orifícios do quartzo e selar com epóxi, deixando secar por alguns minutos. Quando o selo de epóxi estiver seco, iniciar o bloqueio da superfície.

Usando uma agulha de 21 gauge. Puxe um pouco do tampão de bloqueio Degas através de um dos tubos. Lave algumas vezes para remover bolhas de ar e deixe a câmara incubando por pelo menos meia hora antes de prosseguir para o experimento de replicação de molécula única.

Agora que a célula de fluxo foi bloqueada, coloque-a sobre a platina do microscópio. Segure a câmara no lugar com grampos de platina e certifique-se de que o canal de fluxo esteja alinhado ao longo do eixo y. Conecte o tubo de saída da célula de fluxo à bomba de seringa utilizando um tubo conector de diâmetro maior.

Coloque a entrada no tampão de bloqueio e puxe suavemente a seringa para remover qualquer ar presente no tubo. Um leve toque no tubo de saída ajudará a eliminar bolhas de ar aprisionadas na célula de fluxo. Agora, adicione o DNA, diluindo o molde de DNA estoque até 25 picomolar em um mililitro de tampão de bloqueio, e faça fluir na câmara a uma taxa moderada, como 0,025 mililitros por minuto, durante 30 minutos, para permitir uma boa cobertura da superfície com DNA.

Uma vez que o DNA esteja na câmara, remova o excesso de DNA utilizando uma lavagem com tampão bloqueador por pelo menos 200 volumes da câmara de fluxo. Para eliminar todo o DNA livre, ligue o laser e a câmera. O CCD refrigerado precisa atingir a temperatura adequada antes de poder ser utilizado.

Após remover o excesso de DNA e desgaseificar o tampão de replicação, prepare a mistura de reação de replicação com nucleotídeos, DTT e citoxina no tampão de replicação. Em seguida, adicione as proteínas e misture suavemente. Depois, introduza a mistura de reação na câmara de fluxo.

A velocidade do fluxo aqui precisa ser suficiente para esticar o DNA de fita dupla em um canal de fluxo com dois milímetros de largura e 100 micrômetros de altura; 0,04 mililitros por minuto funciona bem. Deixe o tempo necessário para a mistura entrar na câmara, cerca de 10 minutos.

Mova o campo de visão para o lado do canal e foque no material adesivo para garantir que se está próximo à superfície ao focar e iniciar a aquisição de imagens. Ajuste a potência do laser, o foco do microscópio e o ângulo do tufo. Mantenha a potência baixa para evitar qualquer clivagem fotodinâmica do DNA marcado.

Adquira de um a cinco quadros por segundo durante vários minutos, dependendo da taxa de replicação do DNA. Repita para obter trajetórias de replicação mais longas ou mova para um novo campo para observar mais moléculas quando quase toda a mistura de reação tiver sido bombeada para a célula; adicione mais tampão com cit para visualizar outros campos. A obtenção de múltiplas imagens de diferentes moléculas replicadas fornece estatísticas para a determinação da produtividade.

No círculo rolante. No ensaio de replicação, a síntese da fita líder estende a cauda que liga o círculo à superfície e a cauda é convertida em DNA de dupla fita pela polimerase da fita tardia e esticada pelo fluxo laminar mostrado. Aqui está um exemplo de campo de visão com citrino de citosina com excitação em 532 nanômetros.

As pequenas manchas fluorescentes são substratos não replicados ancorados. Observe o comprimento extremo dos produtos e o grande número de produtos por campo. Um campo típico de visão mostrará inúmeras moléculas em replicação, visíveis como linhas brilhantes crescentes de DNA corado. Experimentos com E. coli a 37 graus Celsius apresentam de cinco a 50 moléculas por campo, dependendo da densidade superficial.

A zona de replicação do fago T7 inicia com muito mais eficiência e replicará mais de 50% das moléculas em um campo. Com tal alta densidade, é difícil resolver moléculas individuais, como visto aqui. Portanto, realize o experimento com o fago T7 em concentrações mais baixas de proteína ou menor densidade superficial. Gráficos de trajetórias típicas de moléculas replicantes provenientes de experimentos com E. coli e T7 incluem trajetórias finais de moléculas de E. coli e T7 plotadas em função do tempo. As trajetórias são ajustadas por regressão linear para obter as taxas de replicação, que, neste exemplo, são de 467,1 pares de bases por segundo para E. coli e 99,4 pares de bases por segundo para T7.

Para o T7, as distribuições de taxa das trajetórias de moléculas individuais ajustadas com gaussianas únicas apresentam uma média de 535,5 ± 39 pares de bases por segundo para E. coli e 75,9 ± 4,8 pares de bases por segundo. Para o T7, as distribuições de comprimento dos produtos de replicação são ajustadas com decaimento exponencial simples para obter a produtividade, que é de 85,3 ± 6,1 quilopares de bases para E. coli e 25,3 ± 1,7 quilopares de bases para o G7. Em seguida, mostramos como medir a replicação coordenada de DNA com moléculas individuais.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de funcionalizar adequadamente as lamínulas e criar canais de fluxo limpos e retos. Certifique-se de manter a carga de potência do laser baixa e minimizar a clivagem fotossensível do DNA de longa cadeia. É isso aí.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.