A observação direta de Enzimas DNA Replicação Usando um DNA molécula única Alongamento Assay

Este vídeo demonstra um protocolo para visualizar a replicação do DNA por microscopia óptica de campo amplo utilizando DNA linearizado e quimicamente modificado do fago lambda. O DNA é fixado em uma lamínula de vidro funcionalizada. A extremidade livre do DNA é marcada com um microesfera e o DNA é esticado por meio de fluxo laminar.

Quando a replicação é iniciada, a fita líder começa a se alongar e a fita atrasada encurta devido ao enrolamento. A grande diferença de comprimento entre o DNA de dupla e de simples fita em forças baixas permite a observação direta das conversões do DNA durante a replicação. O comprimento da construção de DNA é monitorado por meio do rastreamento da posição da esfera, o que permite a determinação precisa da taxa e do processo de replicação do DNA.

Olá, sou Ari Ulrich dos Laboratórios de Anto um Vanian e Charles Richardson do Departamento de Bioquímica Biológica e Farmacologia Molecular da Escola de Medicina de Harvard. Hoje vamos mostrar um procedimento para imagem da replicação do DNA em nível molecular único. Utilizamos este procedimento em nossos laboratórios para estudar atividades enzimáticas que ocorrem durante a síntese de DNA.

Então vamos começar. No início deste procedimento, o DNA linearizado do bacteriófago Lambda é modificado por oligonucleotídeos complementares para formar uma forquilha de replicação, um braço complementar da forquilha lambda, um braço biotinilado da forquilha e um iniciador da forquilha. O braço biotinilado da forquilha contém uma biotina ligada à sua extremidade 5', o que permite a ancoragem do molde de DNA à superfície da célula de fluxo.

O DNA lambda é posteriormente modificado por meio da hibridização com outro oligonucleotídeo que contém um grupo diggen, servindo como marcação imunoafim de alta afinidade para a ligação de uma esfera. Para gerar a forquilha de replicação, obtenha o DNA lambda, além de diversos oligonucleotídeos cujas sequências podem ser encontradas no protocolo escrito que acompanha este vídeo. Esses oligonucleotídeos incluem um braço da forquilha biotinilado, um braço da forquilha complementar ao lambda, um iniciador da forquilha e um diggen complementar ao lambda; fosforile o fim 5' do braço da forquilha complementar ao lambda e do fim complementar ao digo genin lambda utilizando a polinucleotídeo quinase T4.

Em seguida, misture o braço complementar da forquilha de lambda fosforilado, o braço da forquilha biotinilado, o iniciador da forquilha e o DNA de lambda na proporção molar de 10 para 10 para 100 para um. No tampão da Ligase de DNA T4, aqueça a mistura a 65 graus Celsius por cinco minutos e resfrie lentamente até a temperatura ambiente desligando o bloco de aquecimento para permitir o adequado emparelhamento dos oligonucleotídeos e da ligase de DNA T4 à mistura, e incube por duas horas. À temperatura ambiente, a Ligase de DNA T4 catalisará o selamento das fissuras entre os oligonucleotídeos e o lambda.

O DNA finalmente é ligado ao digoxígeno complementar lambda e à extremidade do molde de replicação de DNA mediante a adição do digoxígeno complementar lambda fosforilado e da extremidade em tampão de Ligase T4, incubando a mistura por 30 minutos a 45 graus Celsius e, novamente, resfriando lentamente até a temperatura ambiente desligando o bloco de aquecimento. Ligue o digoxígeno complementar lambda fosforilado e a extremidade ao molde de replicação de DNA mediante a adição de ligase T4 de DNA à mistura e incube por duas horas à temperatura ambiente. O molde final de replicação de DNA está agora pronto para uso. Para fixar as microesferas magnéticas ativadas com tioester ao molde de replicação de DNA, elas devem ser funcionalizadas com um fragmento FAB específico para digoxígenina.

Para iniciar este processo, ressuspenda a solução estoque de microesferas e transfira 400 microlitros para um tubo einor. Coloque o tubo em um separador magnético e incube até que a solução fique límpida. Em seguida, remova o sobrenadante por pipetagem. Para ativar os grupos toal para o acoplamento de anticorpos, adicione um mililitro de boid buffer e misture suavemente por pipetagem.

Novamente, remova o sobrenatante com a ajuda de um separador magnético. Em seguida, adicione 240 microlitros do fragmento FAB e ressuspenda as microesferas em 400 microlitros de tampão borato. Misture bem e deixe em incubação em um rotador por 16 a 24 horas a 37 graus Celsius.

Após a incubação, separe as microesferas utilizando o separador magnético e remova o sobrenadante. Lave as microesferas com um mililitro de tampão de lavagem e incube por cinco minutos a quatro graus Celsius, removendo em seguida o tampão com o separador magnético. Esta lavagem é repetida duas vezes.

Para bloquear os grupos tosil livres, adicione um mililitro de BSA contendo tampão tris e incube por quatro horas a 37 graus Celsius. Após a incubação, remova o tampão das esferas utilizando um separador magnético, lave duas vezes com tampão e alíquotas. Para uso, o DNA a ser replicado é ligado a lamínulas de vidro funcionalizadas com Amil lane.

O grupo oxila da trilha de Amil se liga ao vidro, deixando uma amina disponível para ligação a moléculas de peg biotiniladas. Este revestimento ajuda a reduzir a ligação não específica à superfície. Para limpar completamente as lamínulas de vidro, coloque-as em frascos de coloração e encha os frascos com etanol, submetendo-os à sonicador.

Durante 30 minutos, enxágue os frascos e preencha com sonicação de hidróxido de potássio 1 M durante 30 minutos e repita ambas as lavagens. Para a primeira reação de funcionalização, todos os vestígios de água precisam ser removidos. Preencha os frascos de coloração com acetona e sonique por 10 minutos.

Esvazie os frascos e encha novamente com acetona. Prossiga adicionando o reagente sine aos frascos e agite por dois minutos. Em seguida, interrompa a reação com um grande excesso de água.

Em seguida, seque as lamínulas aquecendo-as a 110 graus Celsius no forno por 30 minutos. Depois, prepare a mistura de PEG a aproximadamente 0,2% peso por volume. O PEG biotinilado, juntamente com um espaçador de lamínula de vidro, permitirá a separação das lamínulas; pipete 100 microlitros sobre uma lamínula seca silanizada.

Coloque um segundo lamínula por cima. Incube os lamínulas na solução de PEG por três horas. Em seguida, separe cada par de lamínulas e lave abundantemente com água.

Tenha cuidado para manter os lados funcionais das lamínulas virados para cima, pois apenas um lado será revestido com PEG. Por fim, seque as lamínulas com ar comprimido e armazene-as sob vácuo em um dessecador; as superfícies permanecem estáveis por pelo menos um mês. Assim, dezenas de lamínulas podem ser produzidas em um único lote e utilizadas conforme necessário.

Agora que as lamínulas estão prontas, pode-se montar a câmara de fluxo para o experimento de molécula única. O experimento de molécula única é realizado usando uma câmara de fluxo simples, construída com uma lamínula funcionalizada, fita dupla face, uma lâmina de quartzo e tubos. Uma câmara de fluxo é preparada para cada experimento de molécula única.

Inicie misturando cinco mililitros de tampão bloqueador e 20 mililitros de tampão de trabalho e coloque a mistura em um dessecador para remover quaisquer bolhas de ar em etapas posteriores. Em seguida, espalhe 100 microlitros de uma solução de trabalho de strp din em PBS sobre a superfície da lamínula funcionalizada com PEG e incube por 20 minutos à temperatura ambiente para permitir que o strp din se ligue à biotina superficial. Enquanto isso, corte um pedaço de fita dupla face para ajustar ao tamanho da lâmina de quartzo e marque a posição dos orifícios dos tubos na fita.

Delimite a câmara de fluxo desenhando um canal central com três milímetros de largura e retângulos contendo ambos os orifícios. As câmaras de fluxo podem ser projetadas com dois canais de entrada e dois de saída em formato de Y. Agora, corte a fita marcada ao longo do contorno desenhado, fazendo cortes retos e limpos para garantir que nenhum adesivo se projete para dentro do canal.

Limpe completamente a lâmina de quartzo utilizando acetona para remover o adesivo da construção da câmara de fluxo usada em experimentos anteriores. Encontre o melhor alinhamento do contorno do canal. Remova um lado do revestimento adesivo e coloque cuidadosamente a fita sobre a lâmina.

Tenha cuidado para alinhar corretamente a fita, pois os orifícios de entrada e saída precisam permanecer desobstruídos. Em seguida, prepare os comprimentos cortados de tubo com diâmetro interno de 0,76 milímetro para a entrada e saída da célula de fluxo. Corte a extremidade do tubo em um ângulo de aproximadamente 30 graus para que o tubo não fique pressionado contra o fundo da câmara.

Suspenda o tubo em suportes para tubos de ensaio para facilitar a fixação na câmara de fluxo nas próximas etapas. Neste momento, a incubação da lamínula já deverá ter sido concluída. Enxágue bem a lamínula com água e seque-a utilizando ar comprimido.

Tenha cuidado para não virar a lamínula, pois apenas um dos lados está funcionalizado com peg. Complete a montagem da câmara de fluxo removendo o outro lado do suporte da fita e colocando a lâmina de quartzo sobre a lamínula. Pressione levemente a lamínula para expelir qualquer ar aprisionado no adesivo. Isso ajudará a evitar que bolhas de ar entrem no canal de fluxo.

Selar os lados da câmara com epóxi. Inserir o tubo cortado nos orifícios do quartzo e selar com o epóxi. Deixar secar por alguns minutos.

Uma vez seco, use uma agulha de 21 gauge para puxar um pouco do tampão bloqueador de DGAs através de um dos tubos, a fim de bloquear a superfície da câmara. Lave algumas vezes para remover bolhas de ar e deixe a câmara incubando por pelo menos 30 minutos antes de prosseguir com o experimento de replicação de molécula única. Após os beads funcionalizados com o molde de DNA e a câmara de fluxo terem sido preparados, pode-se realizar um experimento de molécula única.

Para começar, coloque a câmara de fluxo na platina do microscópio. Segure a câmara no lugar com grampos da platina e certifique-se de que o canal de fluxo esteja alinhado com a câmera CCD. Conecte a mola de ar previamente montada à bomba de seringa e aos tubos de saída da câmara de fluxo.

Usando tubos conectores de diâmetro maior, coloque os tubos de entrada da célula de fluxo no tampão de bloqueio e puxe suavemente a seringa para remover quaisquer bolhas de ar dos tubos; sacuda levemente os tubos de saída para eliminar bolhas de ar aprisionadas na célula de fluxo. Após a remoção de todas as bolhas de ar, tampe um dos tubos de entrada com uma agulha e feche um dos tubos de saída dobrando-o em 180 graus e fixando-o com fita adesiva. Antes de adicionar o DNA à célula, dilua o molde de DNA estoque até 10 picomolar em um mililitro de tampão de bloqueio DGAs um x. Passe o molde pela câmara em uma taxa de fluxo moderada para permitir uma boa cobertura da superfície pelo DNA.

Dilua a solução estoque de microesferas para entre duas e quatro vezes 10 à sexta microesferas por mililitro. Em um mililitro de DGAs, adicione um x de tampão bloqueador. Em seguida, vortexe a mistura e sonique por 20 segundos.

Fluxione a solução de microesferas diluída na câmara. Após a adição das microesferas, interrompa o fluxo e deixe a câmara atingir o equilíbrio. Em seguida, feche ambos os tubos de saída.

Quaisquer alterações nos tubos sem que a câmara esteja fechada causarão flutuações de pressão que exercerão uma força intensa sobre as microesferas e romperão as moléculas de DNA ancoradas. Tampe o tubo de entrada usado para carregar as microesferas com uma agulha utilizando o segundo tubo de entrada. Inicie a lavagem da célula de fluxo com DGAs em uma solução de tampão bloqueador, lavando extensivamente.

Agite o estágio batendo levemente para remover quaisquer microesferas que estejam aderidas não especificamente à superfície para verificação. As microesferas estão ligadas ao DNA. Tente mudar a direção do fluxo.

Uma vez que as microesferas livres forem suficientemente removidas, desligue o fluxo e permita que a câmara atinja o equilíbrio. Prepare uma nova mistura de reação contendo as proteínas de replicação conforme indicado no protocolo descrito no texto. Feche o tubo de saída aberto e troque o reservatório de entrada para a mistura de reação recém-preparada.

Abra lentamente a saída para evitar mudanças rápidas de pressão e prosseguir com a reação enzimática. Primeiro, faça fluir a solução proteica para a câmara a uma taxa de fluxo moderada para permitir uma ligação eficiente ao DNA. Desligue o fluxo e permita que a câmara atinja o equilíbrio.

Feche os tubos de saída e substitua o tubo contendo a mistura de reação. Com o tubo contendo o tampão de lavagem de DGAs, lave a câmara para remover as proteínas livres após a lavagem. Novamente, desligue o fluxo e permita que a câmara atinja o equilíbrio.

Feche os tubos de saída e substitua o tubo contendo o tampão de lavagem. Com o tubo contendo o tampão de replicação T7, o tampão de replicação T7 contém cloreto de magnésio que desencadeia o início da reação de replicação. Utilize uma taxa de fluxo de 0,012 mililitros por minuto, correspondente a uma força de arrasto de três pico Newin nos cabos de DNA, usando as condições descritas neste protocolo.

Coloque um ímã permanente de terras raras acima da célula de fluxo antes da imagem para evitar interações não específicas entre as microesferas e a superfície. Posicione um iluminador de fibra em um ângulo de incidência entre 10 graus e paralelo à platina do microscópio próximo ao campo de visão do microscópio com uma objetiva de 10 x e câmera CCD. A iluminação em campo escuro é utilizada para aumentar o contraste no foco da imagem das microesferas usando uma microesfera ligada.

Inicie a aquisição de dados por 20 a 30 minutos com uma taxa de quadros lenta. Em um experimento bem-sucedido, é possível observar simultaneamente 100 microesferas. O experimento deve gerar inúmeras curvas que exibam a síntese da fita líder de DNA.

Para medir as taxas e a processividade do desenrolamento do DNA e da polimerização, é necessário determinar as posições precisas das esferas. Ajuste essas posições com funções gaussianas bidimensionais. Visualize a trajetória rastreando a posição da esfera em cada quadro utilizando software de rastreamento.

Em seguida, plote a posição das esferas em função do tempo utilizando qualquer software gráfico para obter dados de taxa. Ajuste os gráficos com uma regressão linear e calcule a inclinação para o movimento processivo. Determine o comprimento total do DNA do início ao fim de um evento de encurtamento.

Combine todas as medições individuais e trace as distribuições de taxa e produtividade, ajustando os dados utilizando funções gaussianas e exponenciais simples, respectivamente. Acabamos de mostrar como medir taxas e processividade da replicação do DNA em nível de molécula única. Ao realizar este procedimento, é importante garantir que a força e a cisalhamento causados pelo fluxo laminar não afetem as atividades enzimáticas das proteínas de replicação.

Então é isso. Obrigado por assistir e divirta-se em seus experimentos.