Aórtica Assay Anel

O objetivo geral do ensaio de anéis aórticos é fornecer um sistema experimental flexível no qual vasos sanguíneos brotam de fragmentos inteiros da aorta de camundongo dentro de uma matriz tridimensional. Isso é alcançado primeiramente pela dissecação da aorta torácica de um camundongo e, em seguida, pela limpeza cuidadosa de qualquer tecido remanescente ao redor. Fatias da aorta limpa, ou anéis aórticos, são colocadas em poços individuais de uma placa de 48 poços, cada um contendo extrato de matriz basal ou BME moldado em cúpulas.

Uma gota adicional de BME envolve o anel em uma estrutura tridimensional. A matriz pode conter qualquer reagente experimental escolhido. Após incubação por vários dias, pode-se observar vasos brotando dos anéis aórticos e o potencial angiogênico de compostos em teste pode ser avaliado.

Olá, sou Karen Bein do laboratório da Dra. E. Lewis, do Departamento de Bioquímica Clínica da Universidade Beon da Negativa em Be Sheva, Israel. Hoje vamos mostrar um procedimento para o ensaio de anéis aórticos de camundongo. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar os efeitos de diversos materiais na formação de vasos sanguíneos.

Então vamos começar. Para iniciar este procedimento, deixe o extrato da matriz basal ou BME descongelar no gelo ou a quatro graus Celsius. Uma vez descongelado, continue mantendo o BME frio para evitar que ele volte a solidificar.

No dia do experimento, eutanizar um camundongo de seis a sete semanas de idade por injeção padrão de cetamina e xilazina, sangrando rapidamente através das artérias do pescoço, seguido por dislocação cervical. Iniciar o procedimento limpando o animal com etanol 70% em uma cabine de fluxo laminar estéril. Em seguida, trabalhando sob um microscópio de dissecação, usar pinças estéreis e tesoura de dissecação para realizar uma incisão vertical da pele e abrir a parede peritoneal.

O corte deve ser feito para expor o esterno superior, onde a caixa torácica também é seccionada e o diafragma é removido. Em seguida, empurre cuidadosamente todos os órgãos para o lado, expondo completamente a aorta torácica localizada ao lado da coluna vertebral. Com a aorta exposta, insira pinças finas e estéreis entre a aorta e a coluna vertebral. Abra levemente as pinças e levante gradualmente a aorta de seu leito, separando o segmento torácico do restante da aorta.

Agora que a aorta está separada, use uma tesoura afiada para cortá-la do camundongo, começando pela extremidade próxima aos vasos renais e terminando perto do coração. Coloque a aorta torácica ressecada em uma placa de Petri contendo PBS estéril e frio. Agora que a aorta foi removida, os anéis aórticos podem ser preparados utilizando duas pinças estéreis e trabalhando sob um microscópio binocular.

Limpe a aorta torácica do tecido adiposo circundante. Certifique-se de não danificar a aorta e segure-a apenas pelas bordas. A aorta deve ser imersa repetidamente no recipiente de Petri contendo PBS para prevenir desidratação até que seja finalmente limpa.

Agora que a aorta torácica está limpa, utilize uma lâmina cirúrgica e trabalhe sob o binóculo para cortar a aorta uniformemente em anéis de um milímetro. Usando uma régua colocada abaixo da superfície de corte como guia, certifique-se de usar uma lâmina nova e substituí-la periodicamente para manter a afiação. As extremidades da aorta não são utilizadas. Após cortar cada anel, use pinças para transferi-lo com muito cuidado para um novo recipiente contendo PBS frio.

Coloque todos os anéis na mesma placa contendo PBS para garantir que o ensaio seja randomizado. Como cada segmento da aorta possui um potencial angiogênico ligeiramente diferente, mantenha os anéis sobre gelo. Em seguida, prepare a placa do ensaio utilizando ponteiras pré-resfriadas.

Adicione a cada poço de uma placa de 48 poços cerca de uma gota de 150 microlitros de BME frio até que a gota se solidifique em uma cúpula durante o processo. O BME permite o transporte de substâncias, a quimiotaxia celular e, mais importante, a diferenciação e migração celular que levam à formação de novos vasos. Os poços periféricos são preenchidos com PBS para evitar a desidratação do BME. Deixe a gota de BME solidificar a 37 graus Celsius por 20 a 30 minutos. Uma vez solidificado o BME, retire cuidadosamente um anel aórtico da placa de Petri usando pinças, a fim de evitar danos; o anel deve ser transferido para dentro da gota lipídica que se forma entre as pontas das pinças. Devido à tensão superficial do líquido, posicione um único anel aórtico no centro superior de cada cúpula e incube por 10 minutos a 37 graus Celsius. Sobre cada anel, adicione mais 150 microlitros de BME e incube por 20 a 30 minutos.

A 37 graus Celsius, o anel agora está envolto em BME e ensaio. Os materiais podem ser adicionados à placa para iniciar o ensaio. Suplemente previamente o meio livre de soro para células endoteliais humanas com o material experimental ou com suplemento de crescimento para células endoteliais como controle positivo e um controle negativo.

Utilize apenas o meio. Adicione 500 microlitros do meio suplementado com pres a cada poço e incube a 37 graus Celsius por seis a 12 dias. Durante este período de incubação, examine a placa ao microscópio e observe a formação de vasos brotando da aorta e a presença de vasos maduros avançados identificados por vasos com ramificações adicionais.

Deve-se estender a partir do tecido do anel tridimensionalmente e fotografar os anéis entre o sexto e o 12º dia em um estereomicroscópio de contraste de fase padrão. Além disso, colete os sobrenadantes em vários dias entre o sexto e o 12º dia e armazene a quatro graus para uso dentro de um dia ou Eloqua e armazene a menos 20 ou menos 80 para uso futuro. Os sobrenadantes podem ser analisados por várias técnicas, como Eliza para vgf ou ensaio de graxa para níveis de óxido nítrico.

Essas imagens foram coletadas 12 dias após a colocação dos anéis nos poços e incubação com o cultivo, meio apresentado na linha superior das imagens, ou ECGS utilizado como controle positivo para brotamento vascular observado. No painel inferior. Cada imagem é uma representação típica de quatro dos 12 anéis, quantidade normalmente utilizada no ensaio por condição.

O canto de cada anel aórtico em cada poço separado é preto. Quando fotografado dessa maneira, os anéis aórticos expostos a ECGS exibem crescimento vascular e as setas indicam vários dos muitos vasos que se formaram. Cada vaso é caracterizado por cadeias de células endoteliais com ramificações ocasionais, indicando que são maduros.

Nenhum vaso brotante pode ser observado na cultura. Poços com meio no painel superior; acabamos de mostrar como realizar o ensaio de aorta quando se executa este procedimento. É importante lembrar de trabalhar com precisão e compreender suas condições.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.