A Multi-Parametric Sistema Perifusion Islet dentro de um dispositivo Perifusion microfluídicos

Nesta apresentação, apresentaremos um sistema de perfusão palpebral baseado em microfluídica para a medição simultânea da secreção dinâmica de insulina, entrada de cálcio e alterações no potencial mitocondrial de ilhotas pancreáticas em resposta a secretagogos de insulina. O sistema de perfusão é composto por um dispositivo microfluídico de três camadas, bombas de seringa e um coletor de frações de insulina. A entrada de cálcio e os potenciais mitocondriais induzidos por secretagogos são visualizados utilizando uma configuração de microscópio fluorescente.

Olá, meu nome é Ola, um Waller do laboratório do Dr. Val Holter do Departamento de Cirurgia de Transplantes da Universidade de Illinois em Chicago. Olá, sou Don Lee, também do Laboratório de Outubro. Olá, sou Tricia Hart, também do laboratório do Dr. Al Holster.

Hoje vamos mostrar um procedimento para imagem simultânea das pálpebras utilizando um gradiente linear de glicose. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar os olhos e sua função. Então, vamos começar.

O dispositivo microfluídico utilizado para este procedimento é montado a partir de três camadas de PDMS curado geradas por fotolitografia padrão. A primeira camada, gerada a partir de um molde de silicone, possui os poços do dispositivo microfluídico que acomodarão suavemente os olhais em posição, com 150 micrômetros de profundidade e 500 micrômetros de diâmetro. A segunda camada possui canais com 500 micrômetros de altura e dois milímetros de largura.

O centro do canal é expandido para dispersar o fluxo, permitindo uma melhor troca de solução dentro do dispositivo. O poço de troca é feito perfurando um orifício de três milímetros de altura por sete milímetros de largura no centro da camada. A terceira camada é uma placa espessa de PDMS. Para preparar esta camada, faça pequenos orifícios em ambos os lados, alinhados com a entrada e a saída do canal.

Na segunda camada, após as três camadas terem sido geradas, a primeira camada é ligada a uma lâmina de vidro com os poços voltados para cima. Em seguida, a segunda camada é ligada à primeira camada com o espaçamento dos canais voltado para cima. Por fim, a terceira camada é ligada à segunda camada.

Uma vez que as camadas tenham sido unidas, o dispositivo está pronto para uso em experimentos. Utilizando uma seringa de 10 mililitros cheia com etanol a 70% e conectada à porta de entrada do dispositivo com Tai em tubo, esterilize o dispositivo microfluídico fazendo o etanol passar pelos canais do dispositivo. Em seguida, utilizando a mesma configuração, faça passar água desionizada para remover o etanol.

Uma vez que o dispositivo tenha sido esterilizado, coloque-o em uma platina aquecida do microscópio usando tubo de tigon, conecte as bombas de seringa contendo soluções de glicose alta e baixa a um conector em Y. Em seguida, conecte à entrada do dispositivo microfluídico. Conecte a saída do dispositivo microfluídico a um coletor de frações.

Certifique-se de que o tubo esteja apoiado em uma placa aquecida a 37 graus Celsius. É muito importante manter as soluções à temperatura fisiológica durante todo o experimento. Em seguida, utilize o programa LabVIEW para iniciar o gradiente de glicose que será perfundido através da rede microfluídica durante o experimento.

Este software varia a taxa de fluxo de duas soluções de glicose. Ao controlar as bombas de seringa, diversos perfis de gradiente de glicose podem ser criados aqui, como gradientes lineares, em forma de sino e em forma de quadrado. Em comparação com os valores esperados calculados mostrados neste experimento, será utilizado o gradiente linear de glicose de dois milimolares a 25 milimolares, com uma taxa de fluxo variável de 0,01 mililitros por minuto das duas soluções de glicose e uma taxa de fluxo constante de 0,25 mililitros por minuto entrando no dispositivo após a mistura das soluções.

Uma vez que o perfil de gradiente apropriado tenha sido selecionado, teste a estabilidade do gradiente. Primeiro, inicie o sistema de gradiente. Em seguida, inicie o coletor de frações e colete oito frações de um mililitro em tubos eppendorf.

Em seguida, utilizando um glicosímetro, teste a concentração de glicose em cada tubo usando o Excel. Analise os resultados obtidos pelo glicosímetro. A seguir, substitua a seringa com alta concentração de glicose por uma seringa contendo solução de BSA 0,5% em tampão Krebs-Ringer e perfuse 50 mililitros através do dispositivo a uma taxa de um mililitro por minuto.

Isso evitará a absorção inespecífica de insulina nas paredes do microcanal para garantir a precisão ao medir posteriormente os níveis de insulina secretada após a perfusão com BSA. Substitua-o pela solução de alta concentração de glicose reus. Suspenda 25 a 30 ilhotas pancreáticas de camundongo selecionadas manualmente em um tampão Krebs-Ringer contendo dois milimolares de glicose e os corantes indicadores: fura 2:00 AM, para o cálcio, e rhodamine 1 2 3, para os potenciais mitocondriais; incube por 30 minutos a 37 graus Celsius.

Após a incubação, desconecte o dispositivo do sistema de perfusão e carregue cuidadosamente os ilhotes no dispositivo microfluídico inserindo a ponta da pipeta, contendo os ilhotes, na porta de entrada e dispensando lentamente os ilhotes. Após o carregamento, reconecte o dispositivo ao sistema de perfusão, tomando cuidado para não introduzir bolhas. Em seguida, inicie a bomba de seringa para começar a perfundir os ilhotes com KRB contendo dois milimolares de glicose.

Esta etapa irá lavar o corante em excesso do meio, definir os conjuntos de filtros de excitação e emissão e os tempos de exposição a serem utilizados durante o experimento. Em seguida, configure o coletor de frações para coletar em intervalos de um minuto enquanto passa pelas campânulas com a solução de baixa concentração de glicose. Utilize a ferramenta de região de interesse ou ROI do software de imagem PCI simples para definir as áreas ou campânulas que você deseja imaginar.

Além disso, circule a área de fundo que será subtraída após as células terem sido lavadas por 10 minutos, inicie o coletor de frações com gradiente de glicose e comece a aquisição de imagens com lapso de tempo. Após 30 minutos, desligue o software e a bomba de seringa de glicose alta. Continue a perfusão com glicose baixa para remover o efeito da glicose alta.

Após 10 minutos, interrompa o fluxo de glicose baixa desligando a bomba de seringa. Após a perfusão, exporte os dados para o Excel para análise. A quantidade de insulina secretada na perfusão pode ser determinada por olhinhos de camundongo em ELA.

Foram perfundidos com um gradiente linear de dois a 25 milimolares de glicose, conforme mostrado aqui. A entrada de cálcio e a secreção de insulina são desencadeadas após cerca de 13 minutos de perfusão, correspondendo a seis milimolares de glicose. Alterações nos potenciais mitocondriais são observadas mais cedo, como esperado, por volta dos 11 minutos.

Esses dados demonstram a vantagem do uso dessa rede microfluídica para caracterizar a fisiologia dos olhinhos. Acabamos de mostrar como utilizar nosso dispositivo microfluídico de perfusão para o estudo da fisiologia dos olhinhos. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de garantir que não haja bolhas no dispositivo, pois isso poderia fazer com que os olhinhos se movessem durante um experimento.

Além disso, a vazão pode ser ajustada em até um ml por minuto sem perturbar os orifícios. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.