Estimulação cerebral Slice Usando uma Rede microfluídicos e da Câmara de Perfusão padrão

O principal objetivo do projeto que vamos mostrar a vocês hoje é poder controlar espacial e temporalmente a estimulação cerebral. E outro ponto importante é que, com uma simples modificação no já complexo arranjo eletrofisiológico, podemos disseminar este dispositivo microfluídico entre os diversos laboratórios que utilizam atualmente essa estimulação cerebral in vitro. Olá, sou Java Chek Mohammad do laboratório Edington, do Departamento de Bioengenharia da Universidade de Illinois em Chicago.

Hoje vou mostrar como aplicamos um dispositivo microfluídico microfabricado simples para estimulação de fatias cerebrais. O dispositivo para fatias cerebrais que vamos demonstrar hoje é muito útil por diversas razões, sendo a principal delas sua modularidade, que permite adaptá-lo facilmente a uma configuração eletrofisiológica existente sem necessidade de modificações adicionais. Além disso, evita o uso de tubos e bombas, o que normalmente complica qualquer dispositivo microfluídico.

E como estamos utilizando o método de bombeamento passivo, não precisamos de tubos nem de bombas. E a terceira coisa é que se trata apenas de uma fina lâmina de membrana de PDMS colocada entre uma lamínula e uma câmara de perfusão padrão, utilizada em um arranjo padrão de eletrofisiologia. O procedimento que vou demonstrar hoje começa com um molde C oito, fabricado utilizando o processo padrão de litografia SV oito.

E o molde que temos hoje aqui é um molde de dois níveis, sendo que um nível possui o desenho dos canais, os microcanais, e outro desenho para as aberturas de vias que ficam sobrepostas a esses canais, de modo que as soluções que fluem através dos canais possam sair pelas aberturas das vias. Assim, criamos esse molde, que é feito sobre uma pastilha de silicone, e depois utilizamos silicone ou PDMS para despejar sobre o dispositivo e moldar as estruturas presentes na superfície dessa pastilha no PDMS. Portanto, vamos despejar o PDMS sobre este dispositivo.

Em seguida, vamos retirar a membrana de PDMS formada após a cura e ligá-la a uma lamínula. Assim, teremos nosso dispositivo microfluídico. Depois, vamos modificar uma câmara de perfusão padrão revestindo a parte inferior da câmara de perfusão com uma camada fina de PDMS.

E uma vez que tivermos esta câmara de perfusão modificada, vamos pegar o dispositivo microfluídico que fabricamos anteriormente e uni-lo à câmara de perfusão. Existem dois pontos críticos na fabricação do dispositivo microfluídico. O primeiro é que, antes de colocarmos o PDMS, a placa aquecedora deve estar desligada para que o PDMS não polimerize instantaneamente quando o despejarmos sobre a pastilha.

E outro ponto crítico é que os espaçadores utilizados nos quatro cantos da pastilha de silício devem ter uma altura menor que a da estrutura mais alta na pastilha. Isso é necessário para garantir que as aberturas de VR possam ser obtidas durante o processo de cura do PDMS. Aqui estamos neste ambiente limpo modular com paredes flexíveis, e este é o molde que fabricamos utilizando um processo padrão de litografia a C oito.

E é um molde em dois níveis, sendo que o primeiro nível possui o desenho dos canais com quatro entradas e uma saída. Na região central de todos os quatro canais, há vias ou pontos posicionados sobre os canais. Essas estruturas são as marcas de alinhamento criadas durante o processo de fabricação.

E agora vou mostrar como vou removê-lo e realizar a cura do PDMS. Devido ao efeito de borda, a espessura na periferia externa da pastilha é maior do que nos dispositivos reais no centro da pastilha. Então, o que vamos fazer é remover essas marcas de alinhamento usando a lâmina reservada e, para acomodar os pesos, vamos utilizar espaçadores com altura de 140 mícrons, que serão colocados nos quatro cantos da pastilha.

Portanto, você precisa garantir que a lâmina de barbear não chegue perto dos dispositivos reais. Agora vou remover essas partículas SVA usando o spray de ar comprimido e a pastilha já está pronta para a preparação do molde de PDMS. Mas antes de fazer isso, precisamos colocar essas espaçadores, que têm 140 mícrons de altura.

Então, vou posicionar as quatro fitas nos quatro cantos da pastilha. Em seguida, vou verificar se a fita está aderindo corretamente à pastilha. O motivo pelo qual a fita tem 140 mícrons de altura é que o molde bicamada, com os canais e o VS, tem 150 mícrons de altura.

E quando colocamos o peso sobre o PDMS durante a cura do PDMS, queremos garantir que a folha de PDMS fique plana. Por isso, estamos usando quatro espaçadores nos cantos com alturas iguais. Agora vou mostrar como vamos moldar o PDMS e curá-lo para fabricar os dispositivos.

Mas antes de fazer isso, deixe-me mostrar como preparamos a solução de PDMS. Pegamos 10 partes da base e uma parte do agente de cura e misturamos bem devido ao processo de mistura. Veja que geramos muitas bolhas na solução de PDMS; para remover essas bolhas, colocaremos o PDMS no dessecador. Após colocar o PDMS no dessecador por 10 minutos, não há mais bolhas.

E agora a PDMS está pronta para ser usada na cura. Agora vou mostrar como colocaremos a PDMS na pastilha e a curaremos para obter a membrana de PDMS. Então, vou colocar a PDMS na pastilha e depois usar esta transparência para cobrir a PDMS.

E isso nos ajudará a remover o dispositivo sup, separar o dispositivo da transparência e, em seguida, vou colocar os pesos sobre a transparência. O motivo pelo qual estamos usando os pesos é obter uma espessura uniforme do PDMS. E outra questão crítica é obter as aberturas de via.

Portanto, onde quer que haja vs, queremos ausência de PDMS e os pesos nos ajudarão a conseguir isso. Como é possível observar aqui, a placa aquecedora está desligada e a razão para isso é que não queremos que o PDMS cure instantaneamente, então a mantemos desligada. Em seguida, é necessário garantir que a pastilha esteja plana antes de transferir o PDMS.

E agora podemos aplicar o PDMS que preparamos anteriormente. Certifique-se de dispensar o PDMS próximo o suficiente à pastilha para não gerar bolhas. E o ponto mais crítico aqui é a maneira como você coloca a transparência sobre o PDMS.

Você precisa garantir que não gere bolhas devido à colocação da folha. Agora vou posicionar um desses laboratórios de vidro e deixar o excesso de PDMS sair do caminho. Estou colocando mais três laboratórios de vidro e, para garantir que os laboratórios de vidro não se movam, neste molde específico.

E, para essas características específicas, descobrimos que posicionar esses quatro calços de vidro torna o VS. E permite que o excesso de PDMS saia do caminho entre a transparência e a pastilha. Aguardamos de um a dois minutos e, em seguida, podemos iniciar a placa aquecida. Para diferentes moldes e diferentes desenhos, pode ser necessário aumentar ou diminuir o número de calços de vidro para obter as aberturas de via. Agora a placa aquecida está pronta para ser ligada e vou definir uma temperatura de 75 graus.

E uma vez que a temperatura atinja 75 graus, podemos ajustar o temporizador para uma hora e deixar a cura do PDMS ocorrer. Agora que deixamos o PDMS curar por uma hora, podemos desligar a placa aquecedora e deixá-la esfriar até 50 graus centígrados. O motivo para fazer isso é evitar que o SEA trinque.

Se removermos imediatamente da temperatura de 75 graus para a temperatura ambiente, agora podemos desligá-lo e aguardar até que a temperatura atinja 50 graus Celsius. Agora que a temperatura da placa aquecedora diminuiu para 50 graus Celsius, podemos remover os pesos da transparência. Agora podemos remover a pastilha da placa aquecedora e ela está pronta para ser cortada.

Agora a folha de PDMS está pronta para ser removida do molde C oito e precisamos remover o papel alumínio. Em seguida, precisamos remover a folha de transparência. Temos aqui a câmara de perfusão padrão.

Modificamos isso para que possamos alinhá-lo. Os furos, as portas de entrada e saída do dispositivo microfluídico. Assim, essas são as quatro portas de entrada e uma porta de saída na membrana de PDMS.

E estes devem coincidir com as quatro entradas e uma saída na câmara de perfusão. Agora vou deslizar a câmara de perfusão e alinhá-la com os orifícios na membrana de PDMS. Agora que estão alinhados, está pronta para ser cortada.

Agora você pode remover a câmara e, utilizando uma sonda, certificar-se de que todas as bordas da membrana de PDMS estejam soltas para serem removidas. Após fazer isso, podemos usar um congelador para remover a membrana de PDMS e garantir que, ao retirar o PDMS da parte superior do dispositivo, você mova o PDMS muito lentamente para não rasgar a membrana de PDMS.

Agora vou colocar a membrana de PDMS com as cavidades formadas pelos oito moldes SC na parte superior e certificar-me de que ela está plana. A razão pela qual fazemos isso é para que, quando fizermos os orifícios, as portas de entrada e saída, o PDMS não fique irregular no lado que será ligado à lamínula.

Portanto, precisamos garantir que as cavidades estejam no lado superior. Agora podemos fazer os orifícios de entrada e saída para que possamos ver claramente os furos. Colocamos um fundo preto.

Agora vou criar os orifícios de entrada e saída, precisando garantir que não reste nenhum PDMS no orifício. Portanto, removemos qualquer resíduo de PDMS. Agora vamos transferir a membrana de PDMS para outra folha de transparência.

Portanto, podemos tratar a lâmina e a lamínula com plasma e posicioná-las de modo que, novamente, as cavidades permaneçam na parte superior. Assim, uma vez que essa superfície seja tratada com plasma e a lamínula também seja tratada com plasma, podemos unir essas duas superfícies para formar a rede microfluídica, removendo as bolhas de ar entre a lâmina de PDMS. E a transparência pode ser fixada usando fita adesiva.

Isso garantirá que a folha de PDMS fique plana e que a ligação ocorra muito melhor. Em seguida, use fita adesiva na superfície superior para remover qualquer poeira da membrana de PDMS. Agora podemos colocar a lamínula que será ligada à membrana de PDMS.

E agora esses dois PDMS e o vidro estão prontos para serem tratados com plasma. Vamos tratar com plasma o PDMS e a lamínula utilizando este sistema de plasma modificado por micro-ondas, no qual é possível observar que a câmara de vidro nos permite criar o plasma dentro deste micro-ondas. E deixe-me colocar as amostras no interior, criando vácuo dentro da câmara.

Agora posso introduzir oxigênio. Agora o sistema de plasma está pronto para funcionar e vou utilizar 10% de potência e 10 segundos para este sistema específico, a fim de visualizar o plasma. Enquanto o tratamento com plasma está em andamento, aumentamos a potência para cem por cento e apagamos as luzes.

E agora você pode ver o plasma imediatamente após o tratamento com plasma. Você precisa unir as duas superfícies, o suporte de vidro e o PDMS; caso contrário, a superfície do PDMS perderá sua hidrofilicidade devido ao tratamento com plasma. Após posicionar o suporte de vidro, certifique-se de que toda a superfície esteja unida completamente, sem bolhas de ar.

Se houver bolhas de ar, você pode removê-las. Agora, deixe-o de lado por cinco minutos e permita que ocorra a ligação. Aqui temos a câmara de perfusão modificada, na qual modificamos a base da câmara com PDMS.

E isso foi feito anteriormente. Então, colocamos uma película transparente sobre uma placa aquecedora desligada. Em seguida, despejamos a P-D-M-S-P-D-M-S que foi preparada de maneira semelhante à mostrada anteriormente.

Em seguida, colocamos a câmara de perfusão sobre o PDMS e posicionamos um único peso conforme mostrado aqui, deixando curar por 30 minutos a 75 graus Celsius. Agora vou mostrar que, enquanto aguardamos a ligação entre o PDMS e a lamínula, podemos seguir adiante e preparar a câmara. Assim, podemos unir a câmara e o dispositivo microfluídico.

Portanto, precisamos remover o excesso de PDMS de todos os locais onde não é necessário. Remova a transparência e, em seguida, o PDMS. Depois, precisamos remover o PDMS das portas de entrada e saída. Agora a câmara está pronta para ser selada com o dispositivo microfluídico que preparamos anteriormente.

Agora que aguardamos por cinco minutos, o dispositivo microfluídico está pronto para ser separado da transparência, mas é necessário garantir que a remoção da transparência seja feita lentamente, para que o PDMS e a lamínula não se separem. Agora que a câmara de perfusão está pronta, precisamos tratar com plasma a superfície inferior da câmara, onde acabamos de unir o PDMS, e a superfície superior do dispositivo microfluídico que possui o PDMS.

Agora vamos colocar ambas as peças na câmara de plasma e realizar o tratamento com plasma a 10% da potência por 10 segundos. Agora ambas as superfícies foram tratadas com plasma e estão prontas para serem ligadas. Antes de uni-las, você precisa garantir que as portas de entrada e saída na câmara estejam alinhadas com o dispositivo microfluídico.

E como as características que estamos alinhando são grandes o suficiente, não precisamos de nenhum equipamento especial e podemos fazer isso a olho nu. Após alinhar e posicionar sobre a câmara, certifique-se de que todas as superfícies estão em contato e, então, deixe repousar por cinco minutos. Assim, a ligação será suficientemente boa para os experimentos após esperar cinco minutos.

Agora que o dispositivo microfluídico aderiu à câmara, vamos tornar os canais na superfície dos canais hidrofílicos. Assim, quando realmente fluímos uma solução de LCR ou qualquer outro neurotransmissor, as soluções podem fluir mais facilmente. O que vou fazer é colocar todo este dispositivo no plasma e tratá-lo com plasma por um minuto a 10%, de modo que as superfícies internas completas dos canais tornem-se hidrofílicas.

Em seguida, vou enchê-lo com água e levá-lo ao equipamento de eletrofisiologia para realizarmos os experimentos propriamente ditos. Ok, agora estamos prontos para ir ao equipamento de eletrofisiologia e utilizar efetivamente este dispositivo com o fragmento de cérebro. Olá, meu nome é uo.

Estou trabalhando com o Dr. Arrington e a Dra. Fall, do Departamento de Bioengenharia da Universidade de Illinois. E agora vou trabalhar com o dispositivo micro livre que trouxe e acabou de ser colocado sobre esta plataforma. De um lado, podemos ver a tubulação de perfusão.

Do outro lado, podemos ver a tubulação de sucção. Assim, o dispositivo será perfundido com uma solução de LCR, que é borbulhada com 95% de oxigênio e 5% de CO₂. Agora que o microdispositivo V está pronto, vou obter a amostra de tecido cerebral e, em seguida, colocá-la sobre o microdispositivo.

Agora vou colocar a fatia cerebral, hum, sobre as aberturas circulares e, em seguida, usarei o ancoradouro para imobilizar a fatia cerebral. Agora que a fatia cerebral está sendo imobilizada, vou usar neurotransmissores para estimulá-la. Aqui temos quatro entradas, então vou introduzir neurotransmissores em cada entrada utilizando a bombagem passiva a partir dessas quatro entradas até esta saída.

E agora o Dr. Fall vai falar sobre este dispositivo. O que é tão importante para nós? Olá, sou Chris Fall e estudamos a fisiologia cerebral.

E a razão pela qual precisamos usar fatias cerebrais é para obter acesso com microeletrodos e tecnologia de imagem. E até agora, a única maneira de alterar o ambiente de neurotransmissores nessas fatias cerebrais era mudar o fluxo sobre toda a fatia ou aplicar neurotransmissores diretamente usando uma micropipeta muito pequena. Portanto, estamos muito entusiasmados em trabalhar com o Grupo de Eddington.

Essa nova tecnologia nos permitirá abordar grandes áreas do cérebro e alterar localmente o ambiente de neurotransmissores. E então, simultaneamente, agora podemos utilizar nossos eletrodos e nossa tecnologia de imagem e, talvez eventualmente, integrar dispositivos de gravação com múltiplos eletrodos na mesma unidade. Ok, então aqui você vê um corte de cérebro de camundongo no dispositivo microfluídico.

E você pode perceber até mesmo a olho nu que o cérebro é composto por muitas regiões diferentes. Essas regiões desempenham funções distintas. E no animal vivo, essas diferentes regiões do cérebro teriam diferentes tons neuromoduladores e de neurotransmissores.

E queremos ser capazes de replicar isso em nossa câmara de fatias enquanto realizamos gravações eletrofisiológicas e de imagem. Assim, é extremamente útil poder direcionar essas diferentes áreas com diferentes neurotransmissores, em diferentes concentrações e com diferentes cursos temporais. E embora não possamos realmente visualizar neurotransmissores, podemos mostrar aqui um exemplo de corante fluorescente que está sendo injetado na fatia cerebral em diferentes regiões.

Aqui você vê um vídeo no qual estamos fazendo passar um corante fluorescente pelos canais do dispositivo e simplesmente visualizando sua saída pelos poros que foram feitos. E mesmo neste protótipo inicial, é possível observar quão precisa é a resolução espacial com o fluxo. Ao assistir ao vídeo, você verá o corante fluindo para dentro dos canais e, em seguida, saindo pelos orifícios, e depois removeremos esse corante, dando a você uma ideia da resolução temporal do fluxo.

Obrigado por se juntar a nós hoje. Acho que conseguimos demonstrar como a microfluídica e, de fato, as micro máquinas podem ser combinadas com técnicas fisiológicas tradicionais para nos ajudar a compreender como o cérebro funciona. Obrigado.