Visualizando Localização RNA em Xenopus Oócitos

Neste procedimento, o RNA marcado com fluorescência. Os transcritos são injetados em XUS Cytos e sua localização é monitorada. Primeiro, o RNA é marcado com nucleotídeos fluorescentes.

Em uma reação de transcrição in vitro, o RNA é então carregado em um aparelho de microinjeção. Os ovócitos são colocados em uma placa de injeção e cuidadosamente microinjetados. Por fim, os ovócitos são cultivados para permitir a ocorrência da localização do RNA antes da obtenção de imagens no microscópio confocal.

Olá, sou James Gagnan do laboratório da Dra. Kimberly Mallory, do Departamento de Biologia Molecular, Biologia Celular e Bioquímica da Universidade Brown. Hoje vamos mostrar um procedimento para visualizar a localização subcelular de RNA em oócitos de Xap. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a arquitetura de RNA e os fatores proteicos necessários para a localização de RNA durante o desenvolvimento vertebrado inicial.

Então vamos começar. Para iniciar este procedimento, transcreva o mRNA, que é marcado radioativa e fluorescentemente conforme descrito no protocolo escrito acompanhante. Adicione DS para degradar o DNA molde e, em seguida, interrompa a reação adicionando EDTA.

Remova os nucleotídeos não incorporados e outras moléculas pequenas centrifugando através de uma coluna G 50. Em seguida, concentre o RNA por precipitação com etanol, lave e ressuspenda. Após determinar a concentração por contagem de cintilação, dilua o RNA para 50 nanomolar e armazene em alíquotas de cinco microlitros a menos 80 graus Celsius.

Quando estiver pronto para realizar a microinjeção, descongele um Eloqua do RNA marcado e desnature a 70 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, centrifugue por 10 minutos em velocidade máxima em uma microcentrífuga à temperatura ambiente para remover partículas e mantenha no gelo. A seguir, isole os citos, cortando pedaços de ovário xap post lavu em um cônico de 50 mililitros contendo 25 mililitros de três miligramas por mililitro.

Colagenase em um tampão de fosfato de potássio 0,1 molar com pH 7,4. Agite suavemente a 18 graus Celsius devido à variação entre lotes. O tempo de tratamento com colagenase pode variar e deve ser monitorado cuidadosamente por inspeção visual.

Para garantir a desfolha, continue agitando por 15 minutos ou até que os ovócitos estejam visivelmente separados do ovário; deixe os ovócitos sedimentarem no fundo do tubo cônico. Remova a solução e substitua pelo tampão MBSH. Repita este procedimento, lavando mais duas vezes, para um total de três lavagens.

Em seguida, separe manualmente os citoes dos estágios três e quatro no tampão MBSH sob um microscópio óptico comum. Os citoes do estágio três são completamente opacos, mas brancos. Já os citoes do estágio quatro são ligeiramente maiores e salpicados de pigmento.

Células que são ligeiramente transparentes são muito jovens e células que estão totalmente pigmentadas ou exibem distribuição polarizada de pigmento são muito velhas. Por fim, prepare as agulhas para microinjeção utilizando capilares de três polegadas e meia, puxando e afiando-as para produzir agulhas com diâmetro externo de aproximadamente 0,05 milímetros. Agora que os oócitos com mRNA e as agulhas estão prontos, prossiga para a microinjeção.

Comece calibrando a agulha com água desionizada para liberar dois nanolitros por injeção. Em seguida, carregue a agulha usando um microinjetor controlado a gás e calibre o tamanho da gota utilizando um micrômetro. Após a calibração, carregue frontalmente o RNA a ser injetado na agulha. Em seguida, coloque os ovócitos selecionados em uma placa de injeção contendo tampão MBSH, na qual há uma camada de espuma de borracha preta.

O citoplasma branco se destaca bem contra um fundo preto. Em seguida, injete cuidadosamente cada ovócito com dois litros de RNA a 50 nanomolares. Certifique-se de injetar cada ovócito apenas uma vez e verifique regularmente a agulha quanto a entupimentos quando a injeção estiver concluída.

Expulse o RNA restante, enxágue a agulha com água desionizada e carregue o próximo RNA para injeção. Após a injeção, transfira os cítios injetados para um poço de uma placa estéril de 24 poços, até mil. OS CÍTIOS podem ser cultivados por poço.

Remova o tampão e substitua por 400 microlitros de meio de cultura celular por poço. Em seguida, coloque a placa de cultura dentro de um recipiente plástico com uma toalha de papel úmida para manter um ambiente úmido durante a cultura, e incube os ovócitos a 18 graus Celsius por períodos que variam entre oito e 48 horas após o período de incubação desejado. Os ovócitos podem ser preparados para microscopia após a incubação dos ovócitos injetados.

Separar as oócitos mortas e colocar as oócitos viáveis em frascos de vidro. Rotineiramente, observa-se sobrevivência de mais de 90% das oócitos. Substituir o tampão pelo fixador M-E-M-F-A e agitar as células durante 20 minutos.

Proteja os ovócitos da luz solar durante a fixação após o término do período de fixação. Lave os ovócitos removendo o fixador e substituindo por volume igual de tampão MBSH. Repita essa lavagem mais uma vez, totalizando duas lavagens.

Em seguida, lave os ovócitos em metanol anidro. Primeiro, remova metade do volume e substitua por metanol. Repita este procedimento mais duas vezes.

Após essas lavagens, remova toda a solução e substitua por metanol. Repita essa lavagem com metanol mais uma vez. Os ovócitos fixados e desidratados podem ser armazenados a menos 20 graus Celsius até o momento de realizar a imagem.

Antes da imagem, adicione o meio de clareamento de Marie a uma placa fluoro de fundo de vidro da WPI para cobrir a superfície de imagem. Transfira cuidadosamente os ovócitos do metanol para a placa fluoro, minimizando o volume de metanol transferido. Imagem os ovócitos em um microscópio confocal invertido, sendo que tanto o Zeiss LSM five 10 quanto o aica TCSs P fornecem bons resultados. Agora mostraremos algumas imagens representativas da localização subcelular de RNA imediatamente após a microinjeção; RNA fluorescente pode ser visto no núcleo após oito horas de cultura de um controle marcado com fluorescência.

O RNA pode ser visto distribuído uniformemente no citoplasma do ovócito. No entanto, um RNA marcado com fluorescência que contém sequências capazes de recrutar a maquinaria de transporte pode ser observado em processo de localização subcelular no polo vegetal do ovócito. Acabamos de mostrar como microinjetar RNAs marcados com fluorescência em ovócitos e observar a localização do RNA por microscopia confocal.

Ao realizar este procedimento, é importante usar soluções tratadas com DECI para evitar contaminação por RNAs no cultivo, manter suas células em OCM contendo antibióticos e proteger suas células da luz solar sempre que possível para evitar o desbotamento fotográfico. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.