Preparação Individual Drosophila Ovos Câmaras de imagens ao vivo

O objetivo do seguinte experimento é registrar processos dinâmicos em locais U vivos de drosófila. Isso é conseguido primeiramente isolando ovários intactos de fêmeas bem alimentadas com dois dias de idade. Em um segundo passo, folículos individuais são extraídos dos ovários para imagear as câmaras de ovo.

Em seguida, se expressarem uma proteína fluorescente apropriada, câmaras ovocelulares individuais podem ser diretamente submetidas à microscopia ou podem passar por manipulações adicionais, como microinjeção de marcadores fluorescentes antes da aquisição de imagens. Por fim, por meio da análise das sequências de vídeos, pode-se revelar a interação dinâmica de componentes intracelulares. Este método tem nos ajudado a responder algumas questões fundamentais no campo do transporte de RNA e da tradução localizada.

Por exemplo, como a expressão de proteínas que estabelecem o plano corporal é regulada no tempo e no espaço na supervisão in vivo? Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque ele exige considerável rapidez e destreza. Ambas as práticas levarão a resultados melhores.

A demonstração visual deste método é essencial, pois as manipulações das câmaras de ovos são difíceis de descrever por escrito, e é necessária experiência técnica e mãos firmes. Inicie este procedimento colocando uma pequena gota de óleo de halo carbono sobre uma lamínula e reserve. Em seguida, anestesie as moscas preparadas com dióxido de carbono.

Use uma pinça fina e afiada para segurar uma fêmea gorda pelo abdômen anterior. Não segure pelo centro do abdômen. Mantenha a fêmea aproximadamente dois a três centímetros acima da lamínula preparada.

Usando um segundo par de pinças, remova o tecido na extremidade posterior da fêmea. Isso geralmente incluirá tecidos do intestino com pinças limpas. Massageie suavemente o abdômen do extremo anterior ao posterior, como se estivesse espremendo pasta de dente de um tubo.

Os ovários parecem estruturas opacas e grandes e irão aderir à ponta da pinça. Colete os ovários tocando-os no óleo de carbono em halo da lâmina. Em seguida, repita o processo até que quatro a seis ovários sejam coletados.

Antes de isolar as estruturas aéreas, ajuste a fonte de luz do microscópio para que a iluminação incida sobre a lâmina em um ângulo raso e crie sombras contrastantes nos tecidos. Ao dissecar as moscas, é muito importante usar as ferramentas adequadas.

O ponteiro que usamos não é muito afiado para não danificar o tecido, mas suficientemente rombudo para podermos segurar as pinças que utilizamos. Novamente, não muito afiado para não lesar os tecidos, mas com ponta fina o suficiente para manipular os objetos sem entortar a ferramenta. Também é muito importante manter as ferramentas limpas, por isso as limpamos regularmente ao longo do procedimento com pinças fechadas.

Se pare os dois ovários removendo o tecido conectivo na extremidade posterior. A extremidade posterior possui as câmaras de ovos mais maduras. Oriente um ovário horizontalmente com as câmaras de ovos mais jovens voltadas para a sua mão dominante.

Em seguida, segure suavemente a extremidade posterior pelo tecido conjuntivo remanescente e use uma agulha de dissecação ou de tungstênio para separar individualmente os folículos ovarianos, desde o estágio Jamar até o estágio 10, que se separarão uns dos outros, mas os folículos mais velhos permanecerão ligados ao ovário. Com a agulha, arraste cuidadosamente de 15 a 25 folículos separados para o centro da gota de óleo. Se for necessário dissecar mais de um ovário, escolha um de outra mosca.

Descarte qualquer tecido ovariano em excesso e trabalhe rapidamente, pois os citos começarão a exibir alterações fenotípicas devido ao estresse. Após 40 minutos da dissecação do ovário, remova o tecido ovariano excedente do óleo. Utilizando instrumentos limpos para a injeção de citos em estágio intermediário, oriente os capilares perpendicularmente ao eixo longo do lamínula. Para isolar câmaras de ovos em estágio tardio.

É necessário um método diferente para segurar a região posterior do ovário, conforme descrito anteriormente. Introduza a sonda de dissecação na extremidade posterior do ovário, próxima à pinça. Para evitar perfurar as câmaras de ovos, insira a sonda entre as câmaras de ovos em estágios tardios.

Puxe a agulha de dissecação através do ovário até que ela saia nos câmaras de ovos em estágio inicial. Quando realizado corretamente, a sonda removerá o tecido conjuntivo que mantém as áleos e as câmaras de ovos em estágio avançado em posição. Repita este passo até que as áleos estejam espalhadas sobre a lamínula.

Quando as câmaras de ovos não estiverem mais empilhadas umas sobre as outras, esta etapa estará concluída. Usando uma sonda de dissecação, separe as câmaras de ovos em estágios avançados para facilitar o posicionamento da imagem no Estágio 14. Use pinças para segurar as apêndices dorsais das câmaras do pescoço.

Prepare as soluções a serem injetadas por meio de uma breve centrifugação em alta velocidade. Isso irá sedimentar quaisquer depósitos sólidos que possam obstruir a agulha de injeção. Em seguida, carregue a agulha de injeção com uma ponteira de carregamento e fixe cuidadosamente a agulha carregada ao injetor.

Agora coloque um pequeno pedaço de vidro adjacente às amostras e monte a lâmina na platina do microscópio. O vidro servirá como uma parede para quebrar ou desfazer. Desligue a agulha.

Prepare o microscópio e o aparelho de injeção para o experimento. Tendo cuidado para não quebrar a ponta da agulha. Sempre que possível, utilize uma platina automatizada com capacidade de visita a pontos para marcar todos os ócitos nos estágios oito e nove para injeção.

Agora, abaixe a agulha de injeção até que toque o óleo. Selecione o primeiro ponto na lista de pontos marcados e foque no citóforo. Abaixe manualmente a agulha até que ela fique no mesmo plano de foco do citóforo.

Utilizando os controles do manipulador, mova a ponta da agulha de injeção até que ela esteja dentro do local U. Um movimento rápido de punção geralmente é mais eficaz do que um movimento lento. Uma vez no interior, ejetar um pequeno volume da agulha e avaliar visualmente os efeitos.

É necessário repetir. Se a injeção for bem-sucedida, o citoplasma no interior da célula será deslocado. É difícil quantificar a quantidade exata de fluido injetado.

Para aumentar o volume injetado, ajuste a pressão ou a duração do pulso de injeção. Quebre a ponta da agulha para aumentar ligeiramente a abertura da agulha ou utilize simplesmente múltiplos pulsos de injeção antes de selecionar a próxima celda. Levante a agulha de injeção o suficiente no óleo para que ela não colida com outras celdas.

Fazer muitas picadas ou permanecer com a agulha dentro da célula danifica gravemente a câmara do ovo. Portanto, seja rápido. A injeção deve levar menos de 10 segundos.

Se um erro for cometido, avance até a próxima marca em um local. Não perca tempo com danos à visão. Quando a agulha entupir, mova a agulha para o pedaço quebrado de vidro.

Com o vidro e a agulha no mesmo plano focal, empurre suavemente a agulha contra o vidro. Verifique se a agulha está desobstruída pressionando o botão de injeção e observando se algum fluido sai da ponta da agulha. Quando todos os locais dos EUA tiverem sido injetados, mova manualmente a agulha para fora do óleo e posicione-a fora do trajeto do feixe do microscópio.

Certifique-se de que está em uma orientação segura para evitar danos oculares e que as luzes estão apagadas. Para facilitar a velocidade da imagem de fluorescência, isso é essencial. Se transcorreu uma hora ou mais entre o isolamento da câmara de ovos e a injeção de citos, os citos serão difíceis de injetar e exibirão alterações fenotípicas associadas ao estresse.

Problemas semelhantes podem surgir com o manuseio brusco do citóforo ou com a injeção de volumes excessivos. Câmaras de ovos que expressam proteínas fluorescentes transgênicas podem ser visualizadas sem necessidade de injeção. A marcação com MS dois de RNA endógeno pode ser visualizada com bons resultados utilizando os procedimentos de isolamento de tecidos com o procedimento completo sintetizado in vitro.

Alexa, 5 46 kin, o RNA foi injetado em uma câmara de ovos ME 31 BGFP, localizando-se na região anterior dorsal do citoplasma e formando uma cúpula ao redor do núcleo. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em cerca de 10 minutos, desde o momento da dissecação até o início da obtenção de imagens. Ao tentar este procedimento, cuide do tecido trabalhando rapidamente, mas com cuidado. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como registrar processos dinâmicos em citoplasmas vivos de Drosophila.