Transgénese mosaico Zebrafish de Avaliação Sequências Enhancer

Olá, sou Erica Kgi do laboratório de Shannon Fisher do Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento da University of Pennsylvania. Sou Chris Weber, também do Laboratório Fisher. E eu sou Shannon Fisher.

Hoje vamos mostrar um procedimento para analisar a função de elementos reguladores usando transgênese em peixe-zebra. Utilizamos este procedimento para estudar a regulação transcricional de genes importantes no desenvolvimento esquelético. Então, vamos começar.

Para identificar sequências não codificantes ao redor de genes candidatos, utilizamos o algoritmo fast cons, que está disponível como uma faixa no navegador do genoma uc SC. Estamos principalmente interessados em genes expressos durante o desenvolvimento esquelético, mas a mesma abordagem pode ser usada para estudar quaisquer genes expressos no início do desenvolvimento. No exemplo mostrado aqui, identificamos sequências conservadas.

No intervalo que envolve o gene regulador humano, examinamos todo o intervalo até os genes adjacentes e determinamos um valor crítico de pontuação logarítmica específica para tamanho baixo, correspondente aproximadamente aos 5% superiores da sequência não codificante. Após a seleção das sequências, projete os iniciadores usando o primer three para amplificar cada sequência a partir do DNA genômico humano; os iniciadores devem ser escolhidos para amplificar a região conservada mais 30 ou mais pares de bases em cada lado. Amplifique a região de interesse com uma polimerase de alta qualidade utilizando DNA genômico humano e use procedimentos-padrão de biologia molecular em laboratório para clonar o produto amplificado em um vetor de expressão.

O vetor utilizado neste protocolo é PG wc FOS GFPA gateway. Vetor de destino. Após a criação do vetor, instruído a transpor.

A enzima necessária para a transposição é primeiramente transcrita in vitro utilizando o kit M message M machine da Ambion e o plasmídeo PGB 600 antes das injeções experimentais. Teste cada lote de transposases quanto à eficácia, injetando-o junto com um potenciador conhecido, como o socks de camundongo. 10 potenciador.

Para se preparar para as injeções, puxe as agulhas utilizadas para microinjeção a partir de vidro capilar de filamento com diâmetro externo de 1,2 milímetro em um puxador de micropipetas Sutter P 97. Utilize um programa que produza uma ponta resistente com um afunilamento acentuado para penetrar os coriões intactos com uma lâmina de barbear afiada e uma lâmina micrométrica. Quebre manualmente as pontas sob um microscópio estereoscópico até um diâmetro externo de aproximadamente 15 micrômetros.

As agulhas podem ser armazenadas por um dia em um recipiente coberto. Mantenha a população de peixes-zebra em um ciclo regular de luz e escuridão com 14 horas de luz sob condições padrão no dia anterior à realização das microinjeções. Prepare os peixes para acasalamentos programados em pequenos tanques de reprodução.

Coloque três fêmeas ou dois machos por tanque em fileiras paralelas na manhã das microinjeções, logo após o início do ciclo de luz. Combine machos e fêmeas em água tratada do sistema limpo para produção de ovos. Verifique os peixes com frequência e colete os ovos em poucos minutos após a produção para obter lotes bem sincronizados.

Mantenha a produção de ovos por duas a três horas, continuando a combinar grupos frescos de peixes ao longo da manhã com uma pipeta de vidro de cinco e um quarto de polegada de diâmetro interno, equipada com uma bomba de látex. Separe os embriões coletados em placas de Petri de 60 por 15 milímetros, parcialmente preenchidas com meio embrionário, em grupos de 50 embriões. Marque o horário da coleta na tampa de cada placa.

Para cada ninhada de embriões coletados, reserve uma placa com 50 embriões como controle não injetado entre as coletas de ovos. Prepare soluções de injeção frescas misturando os seguintes ingredientes em um tubo de microcentrífuga e armazene em gelo. Coloque as agulhas de injeção em placas de retenção e preencha com 1,5 a dois microlitros da solução de injeção.

Pipetando gotas de 500 nanolitros na extremidade larga de cada agulha. O líquido será atraído para a ponta por ação capilar. Prepare pelo menos duas agulhas para cada solução de injeção.

Carregue a agulha cheia no suporte de agulha manual de uma bomba pico pneumática ou injetor de pressão similar. Configure e conecte ao tanque de nitrogênio conforme instruções do fabricante. Calibre os volumes de injeção medindo o diâmetro das gotículas expelidas em óleo mineral sobre uma lâmina micrométrica, normalmente com um tempo de injeção de 120 milissegundos.

Com uma pressão de 20 PS, obterei uma gota de aproximadamente um nanolitro utilizando um microscópio estereoscópico com ampliação de seis a 10 vezes. Segure o embrião no lugar com um par de pinças finas e empurre a agulha de injeção com pressão constante através da coriona até o vitelo de um embrião em estágio de uma célula ou início de dois células, posicione a ponta da agulha no vitelo logo abaixo dos blastômeros, expulse aproximadamente um litro da solução de injeção e retire a agulha. Para cada construto, injetamos mais de 200 embriões após a conclusão das injeções. Separe os embriões removendo ovos não fertilizados, embriões danificados, injeções malsucedidas ou embriões sem vermelho de fenol nos blastômeros.

Em seguida, incubamos os embriões e o meio embrionário a 28,5 graus Celsius até o momento apropriado para as observações. Agora mostraremos alguns resultados representativos de elementos reguladores que produzem padrões específicos de tecido na expressão de GFP no embrião de peixe-zebra. Estudamos genes expressos em osso ou cartilagem durante.

Aqui está um exemplo de um elemento regulador localizado a montante do gene acan que regula a expressão na cartilagem craniofacial três dias após a fertilização. Aqui há outro regulador, desta vez do gene bumper, que controla a expressão nas células ósseas. Aos cinco dias, entre os muitos reguladores que identificamos, observamos pouca correlação entre a localização relativa ao gene e a regulação da expressão.

Ao escolher sequências para testar, é importante lembrar que um enhancer pode estar centenas de quilobases acima ou abaixo de um gene ou em um dos íntrons, como visto neste embrião. Uma parte substancial das sequências não parece regular a expressão específica de tecido. Essas sequências frequentemente apresentam pouca fluorescência ou podem ter algumas células dispersas em dois locais comuns de expressão ectópica: epiderme e músculo esquelético.

Acabamos de mostrar como identificar elementos potenciais de realce por meio da conservação de sequência e testar sua função por meio de transgênese em mosaico em peixe-zebra. Ao realizar este procedimento, é importante examinar a qualidade do seu DNA e RNA para injeções. Além disso, certifique-se de analisar cuidadosamente todos os embriões injetados, especialmente se você espera expressão apenas em um pequeno grupo de células.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.