Análise da composição completa de paredes celulares das plantas (biomassa lignocelulósica) Parte I: A lignina

A determinação do teor e da composição da lignina nas paredes celulares vegetais começa com material vegetal seco, que é submetido a várias extrações. O material resultante consiste apenas em paredes celulares, que então são divididas para determinar o teor de lignina. O material das paredes é submetido à hidrólise por brometo de acetila e os monômeros solubilizados são quantificados por espectrometria no ultravioleta para a determinação da composição da lignina.

O material da parede é hidrolisado por citólise. Os componentes de lignina solubilizados são então derivados em seus derivados voláteis de sal de trimetilsilano, que podem ser separados e quantificados utilizando cromatografia gasosa em conjunto com espectrometria de massas. A determinação da composição de polissacarídeos da matriz e do teor de celulose é demonstrada em outro vídeo intitulado Análise Composicional Abrangente das Paredes Celulares de Plantas, Parte Dois: Carboidratos.

Olá, sou Marcus Pauley, chefe da instalação analítica Wall no Great Lakes Bioenergy Research Center aqui na Michigan State University. Sou Cliff Foster, gerente da instalação analítica de parede celular. Vamos mostrar a você o procedimento para determinar o teor e a composição de amostras de biomassa vegetal.

As plantas convertem a energia luminosa do sol em energia química, como a biomassa. A biomassa vegetal consiste principalmente de paredes celulares, uma rede complexa de diversos polímeros que envolvem todas as células vegetais. Aqui determinamos a composição dos materiais da parede celular vegetal para avaliar o potencial de transformar essas ligninas Celulose X, que são um recurso renovável altamente abundante, em biocombustíveis.

Hoje vamos nos concentrar no polifenol lignina em outro vídeo intitulado Análise Composicional Abrangente das Paredes Celulares de Plantas, parte dois carboidratos. Vamos focar na análise de polissacarídeos. Para iniciar este procedimento, adicione três esferas de aço inoxidável de 5,5 milímetros a um tubo de rosca de 2 mililitros e cerca de 60 a 70 miligramas de material vegetal seco ao ar ou liofilizado.

O material pode ser moído até se tornar um pó fino utilizando o eyewall, um robô de moagem e dispensação. O eyewall pega o tubo e o agita por 30 segundos, momento em que, devido às esferas metálicas, o material é moído até se transformar em um pó fino; em seguida, o pó vegetal moído, porém compacto, é solto por meio de um procedimento alternativo não robótico de baixo rendimento. A facilitação de um retro é apresentada na parte dois: adicione 1,5 M de etanol aquoso 70% ao material moído, vortexie completamente e centrifugue à temperatura ambiente.

Este tratamento solubiliza a maioria das proteínas e organelas celulares; aspire o sobrenadante e adicione um volume igual, volume a volume, de solução de clorofórmio-metanol ao pellet insolúvel em álcool. Agite bem para ressuspender o pellet e centrifugue. O clorofórmio-metanol extrai os compostos hidrofóbicos, como os lipídios; após a centrifugação, aspire o sobrenadante, ressuspenda o pellet e adicione 500 microlitros de acetona.

Para secar a amostra, evapore o solvente com um fluxo de ar a 35 graus Celsius até secagem completa; as amostras secas podem ser armazenadas à temperatura ambiente até o processamento posterior. Para iniciar a remoção de amido da amostra reus, suspenda o pellet em 1,5 mL de acetato de sódio 0,1 molar, pH 5, tampe os tubos e aqueça-os em um bloco térmico para gelatinizar o amido. Após o resfriamento da suspensão em gelo, adicione a mistura de enzimas degradadoras de amido, tampe o tubo e vortexe completamente; incube a suspensão durante a noite.

No agitador a 37 graus Celsius, um agitador rotativo garante a mistura adequada. Após a incubação durante a noite, interrompa a digestão aquecendo em um bloco térmico a 100 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, centrifugue e descarte o sobrenadante, que contém o amido solubilizado.

Lave o pellet restante três vezes usando 1,5 mL de água cada vez, agitando em vórtex, centrifugando e decantando conforme demonstrado anteriormente. Por fim, reconstitua o pellet em 500 microlitros de acetona e evapore o solvente com um fluxo de ar a 35 graus Celsius até secagem completa. As amostras secas contendo parede celular isolada ou perna, sem celuloses, estão prontas para análises adicionais e podem ser armazenadas à temperatura ambiente.

Inicie pesando de um a 1,5 miligramas de material de parede celular preparado. O material pode ser pesado manualmente ou de forma automatizada com a parede ocular, conforme demonstrado na parte dois. Enxágue as paredes do tubo com 250 microlitros de acetona para recolher o material de parede celular no fundo do tubo e evapore a acetona suavemente sob corrente de ar.

Após a acetona ter evaporado, adicione cuidadosamente 100 microlitros de aceto bromídrico recém-preparado a 25% volume por volume em ácido acético glacial ao longo das duas paredes. Para evitar respingos, um leve brometo decompõe o polímero de lignina em seus monômeros acetilados. Em seguida, tampe o balão volumétrico e aqueça a 50 graus Celsius por duas horas.

Aqueça por mais uma hora, com quatro testes a cada 15 minutos, e, por fim, resfrie em gelo. Após o resfriamento do frasco à temperatura ambiente, adicione 400 microlitros de hidróxido de sódio 2 molar e 70 microlitros de cloreto de hidroxilamina 0,5 molar recém-preparado. Vortexe os frascos volumétricos. Em seguida, neutralize a solução completando exatamente até a marca de 2 mililitros com ácido acético glacial, tampe e inverta várias vezes para homogeneizar. Pipete 200 microlitros da solução contendo os monoaldeídos hidrolisados e solubilizados em uma placa UV específica de 96 poços e leia a placa em um leitor de placas a 280 nanômetros. Leia a placa pelo menos três vezes e calcule a média da absorbância, já que partículas podem causar pequenas variações nos valores de absorbância.

Determine a porcentagem de lignina solúvel em brometo sutil ou A BSL utilizando o coeficiente de planta apropriado com a fórmula apresentada no protocolo escrito. A lignina é uma rede polifenólica composta principalmente por três subunidades: fenol hidroxip-hidroxifenil, guaíl e unidades de cumaril devido à determinação da composição de lignina no material vegetal. Comece transferindo aproximadamente dois miligramas de material da parede celular para um tubo de vidro com tampa rosqueável para citólise.

Em seguida, prepare-se para preparar a solução de 2,5% de fluoreto de boro trifluoreto de etila e 10% de etanotiol em dioxano. Como o dioxano é muito perigoso, não retire nenhuma amostra ou equipamento da capela. Lembre-se de trabalhar com muito cuidado e use um balão cheio com gás nitrogênio para repor o volume perdido no frasco de dioxano com nitrogênio.

Prepare a solução misturando os seguintes volumes por amostra: 175 microlitros de dioxano, 20 microlitros de ETSH e cinco microlitros de BF três. Após a mistura, adicione 200 microlitros da solução a cada amostra. Purgue o espaço livre do frasco com gás nitrogênio e tampe.

Prossiga imediatamente para aquecer as amostras a 100 graus Celsius por quatro horas, com mistura suave a cada hora. Em seguida, pare a reação de lise colocando no gelo por cinco minutos. Então, adicione 150 microlitros de bicarbonato de sódio 0,4 molar para neutralizar e vortex.

Para a purificação dos produtos da degradação da lignina, adicione um mililitro de água e 0,5 mililitros de acetato, vortexie e deixe as fases separarem. A camada de acetato de etila ficará na parte superior e a de água na parte inferior. Transfira 150 microlitros da camada superior de acetato de etila, contendo os componentes da lignina, para um tubo de dois mililitros, certificando-se de que nenhuma água seja transferida.

Após a transferência da camada superior de acetato de etila, evapore o solvente utilizando um concentrador com ar. Adicione 200 microlitros de acetona e evapore. Repita o tratamento com acetona duas vezes para remover o excesso de água.

Em seguida, converta os componentes da lignina em seus derivados voláteis de trimetil-silano. Adicione 500 microlitros de acetato de etila, 20 microlitros de purina e 100 microlitros de N,O-bis(trimetil-silil)acetamida a cada tubo. Incube por duas horas a 25 graus Celsius.

Após duas horas, transfira 100 microlitros da reação para um vial de GC-MS e adicione 100 microlitros de acetona. Analise as amostras por GC equipado com espectrômetro de massas em quadrupolo ou detector de ionização por chama. Para obter informações sobre a coluna e detalhes da corrida, consulte o protocolo escrito em anexo.

Aqui estão alguns resultados representativos da análise de lignina utilizando madeira de álamo como material vegetal. De acordo com esta análise, 22% do material de álamo consistem na polifenol lignina. A composição dos componentes da lignina foi analisada por GCMS.

Os picos são identificados por tempos de retenção relativos utilizando o padrão interno de tetracona ou pelos ícones de espectro de massa característicos em 299 m/z, 269 m/z e 239 m/z para os monômeros S e G, respectivamente. A composição dos componentes da lignina é quantificada ajustando a área total dos picos a 100%. A análise composicional mostra que esta amostra particular contém principalmente unidades siringila ou S. No entanto, unidades guaiacila, ou G, também são abundantes.

Obviamente, a quantidade e a composição das unidades monolignólicas podem variar dependendo do tecido vegetal e da espécie. Acabamos de mostrar como determinar o teor e a composição da lignina em material vegetal para a análise de polissacarídeos. Prossiga para a parte dois.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.