Análise da composição completa de paredes celulares das plantas (biomassa lignocelulósica) Parte II: Os hidratos de carbono

A determinação da composição de polissacarídeos da matriz e do teor de celulose cristalina nas paredes celulares de plantas começa com material vegetal seco, que é submetido a várias extrações. O material resultante consiste apenas em paredes celulares, sendo então fracionado para determinar a composição dos polissacarídeos da matriz. O material da parede é tratado com um ácido fraco para hidrolisar os polissacarídeos não cristalinos, que são principalmente as hemicelulosas, convertendo-os em seus monossacarídeos.

Os monossacarídeos são então derivados em seus respectivos acetatos de aldol voláteis, que são analisados e quantificados por cromatografia gasosa acoplada a um espectrômetro de massas para a determinação da celulose cristalina. As paredes celulares são tratadas com o reagente graph, uma mistura de ácidos que remove os componentes não cristalinos da parede. A celulose cristalina remanescente é degradada em seu monômero glicose, que pode ser analisado colorimetricamente.

A determinação do teor e da composição da lignina é demonstrada em outra publicação em vídeo da J intitulada Análise Composicional Abrangente das Paredes Celulares de Plantas, Parte Um: Lignina. Olá, sou Marcus Pauley, chefe da unidade analítica de paredes celulares no Great Lakes Bioenergy Research Center aqui na Michigan State University. Sou Cliff Foster, gerente da unidade analítica de paredes celulares.

Hoje vamos mostrar como determinar a composição dos polissacarídeos presentes no material da parede celular vegetal, que é a celulose em diversas homocelulosas. Aqui no Centro de Pesquisa em Bioenergia dos Grandes Lagos, desenvolvemos tecnologia para converter esses açúcares em biocombustíveis. Para identificar uma matéria-prima vegetal ideal, precisamos primeiro avaliar o tipo e a abundância de açúcares presentes nessa biomassa.

Em outro vídeo intitulado Análise Composicional Abrangente das Paredes Celulares de Plantas, parte um Lignina, vamos nos concentrar na análise de polifenóis. Então, vamos começar. Inicie este procedimento isolando as paredes celulares.

Triture aproximadamente 60 a 70 miligramas de material vegetal seco com esferas de aço inoxidável de 5,5 milímetros em um tubo com tampa rosqueada SAR TED de dois mil. Utilizando um moinho REM como alternativa de alto rendimento, use um robô de trituração e dispensação denominado eyewall conforme descrito na parte um. Após a conclusão da trituração, remova as esferas de aço.

Continue o isolamento das paredes celulares e a remoção do amido residual conforme mostrado na parte um e descrito no protocolo escrito acompanhante. Pese dois miligramas de material de parede celular de amido DS em um tubo de dois milissegundos. Uma maneira de alto rendimento de realizar esta tarefa é o robô eyewall.

O robô pega um tubo contendo material vegetal moído e faz um furo na parte inferior do tubo. O tubo perfurado é então colocado sobre um alimentador VI. Um tubo vazio é colocado em uma balança e deslocado sob o alimentador VI; através de vibração, o material percola pelo furo no tubo superior carregado e cai no tubo inferior vazio até que a quantidade desejada de material seja acumulada.

Adicione 100 microgramas de acetol como padrão interno. Enxágue as paredes do tubo com acetona para recolher o material da parede celular no fundo do tubo e evapore a acetona suavemente sob corrente de ar. Em seguida, realize a hidrólise com ácido fraco.

Adicione cuidadosamente 250 microlitros de ácido tricloroacético dois molar ou TFA a cada amostra, certificando-se de que nenhum material seja salpicado nas paredes dos tubos. Tampe bem os tubos e incube a 121 graus Celsius em um bloco de aquecimento por 90 minutos. Em seguida, resfrie os blocos de aquecimento e as amostras em gelo e centrifugue os tubos a 10.000 RPM por 10 minutos.

Transfira 100 microlitros do sobrenadante ácido contendo os açúcares solubilizados do polissacarídeo da matriz para tubos com tampa rosqueável, tomando cuidado para não perturbar o material do pellet. O pellet pode ser utilizado para o ensaio de celulose cristalina. Evapore o TFA em um tubo de vidro sob um fluxo suave de ar em um dispositivo de evaporação.

Adicione 300 microlitros de dois propanol para remover o ácido em excesso, agite em vórtex e evapore a 25 graus Celsius. Repita por um total de três vezes. Para permitir a identificação dos monossacarídeos por cromatografia gasosa, realize uma derivatização em acetato de aldol.

Primeiro, reduza os monossacarídeos aos seus aldóis abertos correspondentes, que são então acetilados. Consulte o protocolo escrito em anexo para obter instruções detalhadas. Cada etapa do procedimento segue o protocolo previamente descrito, com adição do reagente, incubação e evaporação sob fluxo de ar, seguida pela remoção do excesso de reagente por meio de várias etapas de lavagem.

Nas etapas finais, os acetatos aldólicos são extraídos. Primeiro, adicione 500 microlitros de acetato de etila e agite suavemente. Em seguida, adicione dois mililitros de água, tampe os tubos e vortexie; centrifugue os tubos a 2000 RPM por cinco minutos para obter camadas separadas e claras, com acetato de etila na parte superior contendo os acetatos de Al Dettol e água na parte inferior. Pipete 50 microlitros da camada de acetato de etila para frascos de GCMS com inserções e dilua adicionando 100 microlitros de acetona ao frasco de GC, que pode ser armazenado a quatro graus Celsius.

Se a análise por GCMS não for realizada imediatamente, injete as amostras em um cromatógrafo a gás equipado com espectrômetro de massas em quadrupolo. Para obter informações sobre a coluna e detalhes da corrida, consulte o protocolo escrito em anexo. O material inicial para determinação do teor de celulose cristalina pode ser material de parede celular isolado ou material de parede já tratado com o ácido fraco TFA, imediatamente após o tratamento ácido ou na forma seca armazenável.

Após remover o excesso de TFA com isopropanol conforme mostrado anteriormente, adicione ao pellet de TFA em dois M sars o reagente up degra um M, composto de ácido acético, ácido nítrico e água, adicionando numa proporção de volume de oito para um para dois. Tampe o tubo firmemente, vortexie e aqueça em bloco aquecedor a 100 graus Celsius por 30 minutos. Como resultado deste tratamento, apenas celulose cristalina permanece no pellet.

Todos os outros polissacarídeos são hidrolisados em amostras frias no bloco, de gelo até temperatura ambiente ou mais fria. Em seguida, centrifugue as amostras a 10.000 RPM por 15 minutos; após a centrifugação, descarte o sobrenadante garantindo que o pellet não seja perturbado e que nenhum material do pellet seja removido. Para esse fim, deixe aproximadamente 150 microlitros do sobrenadante no tubo e lave o pellet várias vezes com água.

Em seguida, realize uma hidrólise com ácido sulfúrico concentrado para hidrolisar completamente o cristal e o pellet de celulose em glicose. Comece adicionando 175 microlitros de ácido sulfúrico 72% ao tubo sarta e incube por 30 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação inicial, vortexe a amostra e incube por mais 15 minutos.

Em seguida, adicione 825 microlitros de água e agite em vórtex e centrifugue as amostras a 10.000 RPM por cinco minutos. Pode haver algum material marrom e solúvel, principalmente lignina, permanecendo no tubo, enquanto a glicose está no sobrenadante. O teor de glicose do sobrenadante é analisado utilizando o ensaio colorimétrico com anthrone.

Este ensaio é realizado em uma placa de microtitulação de poliestireno com 96 poços. Prepare uma curva padrão de glicose em duplicata, seguindo as instruções no protocolo escrito fornecido. Prepare as amostras combinando 10 microlitros de cada amostra, sobrenadante e 90 microlitros de água em poços separados da mesma placa de microtitulação; finalize adicionando 200 microlitros do reagente recém-preparado e descartado.

Em seguida, aqueça a placa por 30 minutos a 80 graus Celsius em uma estufa com um espalhador de calor de alumínio. Observe que as amostras contendo glicose mudam de amarelo para verde-azulado quando o aquecimento estiver concluído. Deixe a placa esfriar até a temperatura ambiente e agite bem.

Leia a absorção em 625 nanômetros utilizando um leitor de microplacas. O teor de glicose, unidade estrutural da celulose, é calculado com base na absorbância em comparação com a curva padrão estabelecida na mesma placa. Abaixo seguem alguns resultados representativos da análise de polissacarídeos de um fragmento de madeira de álamo.

Os picos do cromatograma gasoso são identificados por perfis de massa e/ou tempos de retenção de padrões. Os monossacarídeos são quantificados com base em curvas padrão. A análise de açúcares dos polissacarídeos da matriz mostra uma alta abundância de xilose, representando a xilana hemicelulósica, mas outros açúcares também estão presentes.

De acordo com a análise, 40% do material de álamo consiste em cristal e celulose. Observe que esses teores e composições podem variar de planta para planta ou entre diferentes anatomias vegetais. Acabamos de mostrar como determinar o teor de polissacarídeos e a análise composicional da biomassa lignocelulósica para a análise da lignina polifenólica.

Assista à primeira parte. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.