A importância da concentração de proteína correta para Cinética e Determinação Affinity na estrutura-função Análise

O objetivo geral deste artigo em vídeo é fornecer respostas às duas seguintes perguntas. Primeira, os estudos de interações proteicas podem ser realizados de forma mais confiável mediante a medição da fração de uma amostra proteica que é realmente capaz de se ligar a outra proteína? Segunda, como a análise cinética pode nos proporcionar uma melhor compreensão das relações entre estrutura e função?

Essas duas questões serão abordadas em um experimento envolvendo o Corp X 100, um instrumento que detecta interações proteicas em tempo real sem o uso de marcadores. Este experimento examinará a interação da cistatina B bovina com a protease cisteínica papaína, sendo que a estrutura cristalina das duas proteínas em complexo indica diversos resíduos envolvidos na ligação à protease, a fim de determinar como cada um dos resíduos interagentes afeta a interação entre cistatina B e papaína. Várias variantes da cistatina B são produzidas por meio de mutagênese direcionada a sítios.

Em tais experimentos, há sempre a possibilidade de que proteínas recombinantes não se dobrem corretamente, agreguem ou se deteriorem, levando a resultados incorretos e irreprodutíveis. O VIACORE X 100 tem a capacidade de determinar a fração de proteína disponível para ligação por meio da análise de concentração livre de calibração, abreviada como CFCA. Esta abordagem permite determinar a concentração de proteína com atividade de ligação preservada, mesmo quando padrões de calibração não estão disponíveis.

CFCA será utilizado aqui para determinar a concentração das variantes da cistatina B. Esses dados serão então usados como entrada na determinação da cinética de ligação das variantes da cistatina B à Pepin, que também é avaliada utilizando BOR X 100. Olá, sou CLA gram da GE Healthcare na Suécia.

Hoje, minha colega Eva Pool mostrará como realizar a análise da relação estrutura-função utilizando BOR X 100. Proteínas recombinantes podem apresentar dobramento inadequado ou perda da atividade de ligação ao longo do tempo, e esse comportamento não pode ser detectado por métodos que dependem da medição da concentração total. Isso pode, na prática, levar a dados cinéticos incorretos após as medições de concentração por meio da análise de concentração livre de calibração. B.A core X 100 é utilizado para analisar a cinética e a afinidade da interação de variantes da cistatina B com pepane.

Esses parâmetros fornecerão uma compreensão do mecanismo de ligação. Começamos com uma breve explicação do delineamento experimental, então vamos começar. A interação entre a cistina, a protease papaína e o inibidor cistatina B é dominada por contatos hidrofóbicos, conforme revelado pela estrutura cristalina das duas proteínas em complexo.

Pelo lado do inibidor, as áreas de contato são as extremidades N e C terminais e dois loops em alça. Neste estudo, foram analisados quatro mutantes, cada um dos quais contém uma mutação de cisteína para serina introduzida com o objetivo de prevenir a dimerização da cistatina B. Com base no contexto revelado na estrutura cristalina, a leucina 73 foi mutada para glicina, a histidina 75 para glicina e a tirosina 97 foi alterada para alanina. As duas mutações para glicina foram introduzidas para examinar a importância das cadeias laterais da histidina 75 e da leucina 73 para a ligação à pepsina; o resíduo de tirosina foi mutado para alanina a fim de investigar a interação entre a extremidade C terminal da cistatina B e a pepsina.

Os três mutantes duplos, bem como o mutante simples INE três para a linhagem síria, são testados quanto à sua interação com uma variante cataliticamente inativa da papaína S-metil popina. Essa forma cataliticamente inativa da protease possui um grupo metila ligado à CYS 25 na fenda ativa. Para simplificar, chamaremos esta variante de propan ao longo do protocolo.

CFCA depende da medição da taxa de ligação em condições nas quais a taxa é limitada pela difusão das moléculas do analito até a superfície. Isso é favorecido por altos níveis de imobilização do ligante. Antes de iniciar o procedimento de imobilização, coloque o tampão HEPs utilizado nos experimentos na bandeja do lado esquerdo e insira ambas as tubulações.

Coloque também uma garrafa vazia de resíduos na bandeja da direita. Em seguida, insira um novo sensor Gypsum Five no instrumento, inicialize-o por meio do software Core X 100 e, na tela inicial, clique no item da ferramenta chip de encaixe. Clique em iniciar encaixe no software.

Em seguida, utilize o assistente de imobilização para configurar o papel e a imobilização, direcionando o acoplamento ao CM cinco a partir da tela inicial: clique no botão outras opções e, em seguida, selecione assistentes. Isso exibe uma janela com os assistentes disponíveis. Selecione imobilização e clique no botão novo. No canto inferior direito, aparece a primeira tela do assistente de imobilização, onde o acoplamento direcionado ao sensor de gesso cinco é o padrão.

Marque a caixa abaixo da célula de fluxo dois para imobilizar na célula de fluxo dois. A célula de fluxo um é deixada inalterada para ser usada como superfície de referência entre as três opções disponíveis abaixo. Marque a caixa especificar tempo de contato; o nível de destino à direita muda para tempo de contato, especifique um tempo de contato de 900 segundos.

Em seguida, insira os parâmetros de imobilização na solução de molécula de captura ou ligante. Insira papaína. Depois clique em próximo.

A próxima tela exibe o layout do suporte de amostras. A posição um conterá etanolamina utilizada para desativar os grupos ativos remanescentes após a acoplamento de direcionamento da papaína ligante à superfície do chip. Insira a solução de etanolamina na posição um na posição dois.

Coloque o ligante papaína, que é armazenado em excesso de sulfato de metila, e dilua para 50 microgramas por mililitro em tampão de acetato de sódio 10 milimolar, pH 4,5. Reconstitua os reagentes de acoplamento EDC e NHS do kit de acoplamento de aminas com água bidestilada; pipete 85 microlitros de EDC em um frasco. Tampe-o e coloque-o na posição três.

Utilize o mesmo volume de NHS na posição quatro. Observe que o arquivo cinco deve estar tampado e vazio para que o instrumento possa misturar ED, C e NHS neste arquivo. Lembre-se também de preencher o arquivo de lavagem na posição H2O com água desionizada fresca.

Quando a grade for preenchida de acordo com o esquema na tela, clique em carregar amostras e insira a grade no instrumento. Quando a grade for carregada, clique em próximo. Antes do início da corrida, é exibida uma lista de verificação.

Certifique-se de que todos os itens da lista sejam cumpridos quando forem aplicáveis. A corrida é iniciada pressionando o botão de início. A corrida é iniciada durante o procedimento de imobilização.

Os dados são coletados em tempo real. Primeiro, os reagentes de acoplamento são injetados. Em seguida, o papel é acoplado à superfície do chip e o procedimento termina com a desativação dos ésteres ativos remanescentes.

Após a corrida, uma janela de diálogo resume o resultado da corrida. Nesta janela, o nível de imobilização é exibido. Todo o procedimento de acoplamento deve resultar em cerca de 3000 RU de papaína imobilizada.

Uma vez que a papaína tenha sido imobilizada no chip sensor, inicie a análise CFCA diluindo as amostras do mutante da cistatina B até uma concentração total de cerca de 10 nanomolares em pelo menos 300 microlitros. Registre o fator de diluição, pois o utilizaremos posteriormente na configuração do ensaio. Comece abrindo a janela do assistente, conforme descrito na seção anterior na seção de concentração da pasta do ensaio.

Escolha calibração livre, depois escolha novo. A primeira tela do assistente mostra a sequência de injeção. As configurações podem permanecer inalteradas, já que o chip sensorial CM5 e uma abordagem de ensaio de imobilização direta são utilizados aqui.

Clique em próximo na tela seguinte. Mantenha as caixas de seleção prime antes da execução e executar ciclos de inicialização marcadas. Além disso, mantenha o número padrão de ciclos de inicialização inalterado em três.

Digite o tampão heaps no campo de nome da solução. Em seguida, clique em próximo. Na tela seguinte, insira o nome da solução de regeneração, que é hidróxido de sódio 20 milimolar.

Mantenha os outros parâmetros inalterados. Clique em próximo para visualizar a tabela de amostras. Prepare as amostras de acordo com a tabela de amostras.

Cada linha na tabela de amostras resulta em dois ciclos. Um com uma vazão de 10 microlitros por minuto e outro com 100 microlitros por minuto. Inicie a corrida com um branco.

Em seguida, insira o nome, fator de diluição, coeficiente de difusão a 20 graus Celsius e peso molecular. Para cada mutante, o coeficiente de difusão pode ser calculado utilizando a ferramenta online no site do produto. Um link para esta ferramenta é fornecido no navegador de suporte do software.

Como é recomendado executar cada amostra em duplicata, copie toda a tabela desde a linha em branco até a última amostra e cole-a na parte inferior da tabela. Clique em próximo para continuar. A próxima tela exibe o suporte para amostras.

Coloque as amostras e os reagentes no suporte de acordo com o layout descrito pelo software. Carregue o suporte no instrumento pressionando o botão carregar amostras. Em seguida, clique em próximo.

Após carregar as amostras, é exibida uma tela de lembrete com uma lista de verificação. Certifique-se de verificar todos os itens e, em seguida, pressione iniciar. Os dados são coletados em tempo real durante a execução.

Quando a execução for concluída, feche a janela que exibe os dados coletados. Observe que um novo item de resultado apareceu na janela principal. Para calcular as concentrações a partir dos dados, selecione o novo item de resultado e clique no botão.

Avalie por meio do Core X 100. Inicie o software de avaliação, que exibirá todos os dados coletados na barra de ferramentas; selecione análise de concentração e, em seguida, calibração livre no menu. Na primeira janela, escolha os dados a serem incluídos na análise.

Percorra a lista e avance pela lista de visualização para ver os dados de todas as amostras. Se desejar excluir quaisquer dados, remova a marca de seleção da lista. Clique em próximo para iniciar o cálculo.

O modelo de interação CFCA é automaticamente ajustado aos dados experimentais; quando o ajuste é concluído, os resultados são exibidos para cada amostra na janela de resultados. Percorra os ajustes de cada amostra selecionando a linha correspondente na tabela. A coluna chamada concentração medida mostra a concentração na amostra que foi analisada.

A concentração na amostra original é calculada utilizando o fator de diluição inserido anteriormente e exibida na coluna de concentração calculada; ao concluir, clique em finalizar para salvar o resultado. Agora que conhecemos as concentrações das proteínas provenientes da análise por CFCA, temos uma excelente base para nossas medições cinéticas subsequentes. A análise cinética agora nos ajudará a compreender a importância de resíduos de aminoácidos-chave para o mecanismo de ligação.

Vamos começar com a configuração da análise cinética. A análise cinética inicia-se encaixando um novo chip sensor CM5 no instrumento na tela inicial. Escolha criar um fluxo de ensaio para a afinidade cinética.

No canto superior esquerdo, aparece uma janela de diálogo onde se insere as informações sobre o ligante. Digite o nome papaína na caixa de nome do ligante e escolha outra proteína na lista de tipos de espécies. Em seguida, selecione imobilizar o ligante covalentemente utilizando o chip sensorial CM cinco dentre as duas abordagens alternativas de ligação do ligante apresentadas; o fluxo de trabalho recomendado do ensaio agora é exibido no lado direito da janela.

Ele começa com uma etapa de imobilização seguida por uma etapa de ensaio. Pressione continuar para prosseguir. Salve o fluxo de trabalho do ensaio conforme solicitado, inserindo um nome e pressionando salvar.

O software agora delinea o fluxo de trabalho do ensaio com botões associados a cada etapa. O primeiro passo na preparação da superfície sensorial é encontrar um pH de mobilização. Como esse pH é conhecido, pressione inserir valor conhecido na caixa de diálogo que aparece.

Digite o nome do tampão acetato e pH 4,5 e escolha salvar. O fluxo do ensaio agora é atualizado com uma marca de seleção verde para indicar que esta etapa foi concluída. Agora é a hora de imobilizar; pressione o botão executar na etapa de imobilização.

Isso abre o mesmo assistente utilizado anteriormente para o propano e imobilização na análise CFCA. A imobilização da papaína para análise cinética é configurada da mesma forma aqui, exceto pelo fato de que uma solução mais diluída é injetada por um tempo menor. Isso é feito para imobilizar menos papaína, evitando situações em que as taxas de ligação das cistatinas ou mutantes sejam limitadas por difusão, permitindo que os dados cinéticos sejam medidos isoladamente. Como o nome do ligante e o pH de imobilização foram inseridos em etapas anteriores do fluxo de ensaio, ambos já estão pré-definidos aqui.

A única atualização necessária é de 50 segundos para o tempo de contato. A imobilização prossegue então conforme mostrado anteriormente. O nível de ligação esperado após a imobilização é de 50 R ru.

Uma marca de seleção verde ao lado do botão de execução indica que a imobilização está concluída. Em seguida, insira a solução de regeneração no fluxo de trabalho na etapa. Encontre as condições de regeneração clicando em inserir valores conhecidos na caixa de diálogo que aparece.

Insira a solução de regeneração e o tempo de contato. Em seguida, clique em salvar. Agora que o ligante está imobilizado e as condições de regeneração foram inseridas, está tudo pronto para gerar dados cinéticos na caixa de ensaio de afinidade por cinética; pressione o botão executar para iniciar o primeiro passo da cinética.

O assistente de afinidade descreve a sequência de injeção de cada ciclo para cinética de ciclo único, que é usada aqui; não é necessário alterar nada. Clique em avançar para prosseguir. Na próxima etapa, mantenha as configurações padrão que indicam o condicionamento do sistema antes da execução.

Escolha executar um único ciclo de inicialização para equilibrar a superfície do chip. Em seguida, defina os parâmetros de injeção da amostra. Como a solução de regeneração foi especificada anteriormente e a configuração já está predefinida, não é necessário alterar nenhum dos parâmetros na tela.

Clique em próximo. Por fim, especifique as amostras. Insira duas linhas para cada variante mutante, uma em branco e outra com a amostra.

Um ciclo em branco é indicado ao definir o parâmetro de maior concentração como zero. Dois. Variantes da cistatina B podem ser ajustadas em cada corrida. Para cada mutante, insira o peso molecular, a maior concentração e o fator de diluição, e pressione próximo.

No próximo ecrã, o suporte para amostras é apresentado esquematicamente. Prepare uma série de diluições das amostras proteicas e coloque os frascos com tampas no suporte. Conforme indicado no ecrã, um frasco com tampão é colocado na posição 13 e um frasco com a solução de regeneração é colocado na posição 14. Certifique-se de preencher a posição da água com água fresca.

Coloque a grade na máquina e carregue as amostras pressionando o botão carregar amostras e clique em próximo. Como antes, realize uma verificação final antes de prosseguir com a execução do experimento pressionando iniciar; os dados de interação aparecem em tempo real. Quando a execução terminar, prossiga imediatamente com a execução das demais variantes da cistatina B conforme acabou de ser demonstrado.

Se as demais variantes da cistatina B forem executadas em sequência, omita a etapa de preparação inicial e o ciclo de inicialização desmarcando as caixas de seleção correspondentes na etapa. Quando cada execução for concluída, os dados poderão ser acessados por meio do link. Todos os resultados no fluxo de trabalho do ensaio.

Uma janela de diálogo com todos os resultados gerados neste fluxo de trabalho é exibida. Para calcular as constantes de taxa cinética, selecione o resultado a ser avaliado e pressione avaliar; um software de avaliação X 100 é iniciado novamente, mostrando todos os dados coletivos. Selecione cinética de afinidade no menu da barra de ferramentas.

No primeiro painel, o mutante da cisteína três para o mutante sírio é selecionado para avaliação. Os dados desse mutante são exibidos juntamente com a corrida em branco realizada para este mutante; prossiga clicando em Avançar. A tela seguinte mostra os dados com a corrida em branco subtraída da corrida com a amostra.

Escolha avaliar a cinética clicando no botão de cinética. Agora, escolha ajustar os dados a um modelo de interação um a um. Ao clicar no botão ajustar, o ajuste é exibido na tela conforme é calculado.

Uma vez pronto, os controles de qualidade são automaticamente aplicados e destacados na parte inferior. Examine os itens de controle de qualidade e, em seguida, analise os dados dos grampes sensoriais para garantir que os grampes sensoriais apresentem curvatura suficiente. Além disso, examine o gráfico de resíduos, que mostra as diferenças entre os dados coletados e o modelo ajustado.

Observe atentamente os desvios sistemáticos e não aleatórios. Este ajuste é aceitável. Agora, examine os dados cinéticos na guia de relatório.

A constante de taxa de associação, a constante de taxa de dissociação e a constante de dissociação no equilíbrio. Quando concluído, pressione finalizar e repita o mesmo procedimento para todos os outros mutantes. A seguir, apresentam-se resultados representativos da análise de CFCA para as diferentes variantes da cistatina B examinadas.

Os dados de concentração de ligação específica são extraídos dos sensorgramas obtidos em taxas de fluxo de 10 e 100 microlitros por minuto. Ao comparar a concentração determinada por uma medição de dois 80 com aquela determinada por CFCA, é evidente que, embora na maioria dos casos a proteína esteja totalmente ativa para a variante leucina 73 glicina, a fração de proteína ativa é muito baixa. A cinética da ligação das variantes da cistatina B à pepina é determinada utilizando cinética de ciclo único.

Os gráficos do sensor mostram dados subtraídos do branco e do referência, com a cinética de um modelo de interação um para um sobreposta em preto. A concentração de ligação específica medida por CFCA para a variante leucina 73 é de apenas cerca de 10% da concentração total de proteína, conforme determinado por uma medição de dois 80. Ao utilizar a concentração correta no cálculo dos parâmetros cinéticos, torna-se evidente que a taxa de associação da leucina 73 é semelhante à das outras variantes.

Embora as taxas de associação das mutantes sejam comparáveis à da proteína selvagem, a constante de taxa de dissociação das mutantes pode ser cerca de duas ordens de grandeza maior, com um aumento correspondente na constante de dissociação no equilíbrio. A redução nas afinidades depende principalmente de taxas de dissociação aumentadas, indicando que tanto o segundo loop de ligação quanto a extremidade C-terminal da cistatina B contribuem para a afinidade de ligação ao manter o inibidor ligado à enzima após a formação do complexo. O uso da análise de concentração livre de calibração foi essencial para essa conclusão, pois uma das mutantes revelou ter uma atividade de ligação muito baixa. Meu colega Pol agora lhe mostrou como usar o bi core X 100 em um estudo funcional estruturado. Ao realizar esses experimentos, é importante lembrar que, embora tanto a análise de concentração quanto a cinética se baseiem no mesmo procedimento de ligação, as condições experimentais são bastante diferentes.