Analisar grandes complexos de proteínas por espectrometria de massa estruturais

O objetivo geral do experimento a seguir é caracterizar grandes complexos proteicos utilizando espectrometria de massas estrutural. Isso é alcançado pela preparação de capilares revestidos com ouro para ionização por eletrosspray em fluxo nanométrico. Como segundo passo, a amostra é preparada e o espectrômetro de massas é calibrado para medições de alta massa.

Em seguida, as condições experimentais são otimizadas para manter os complexos proteicos intactos na fase gasosa. Em seguida, são adquiridos espectros de MS e de MS/MS. Os espectros de MS mostraram estados de carga correspondentes em massa ao complexo intacto, enquanto experimentos de MS/MS geraram o padrão de associação de monômeros e complexos desprovidos de subunidades.

Olá, sou Naam Kiba do Laboratório de Miron no Instituto de Ciências Whiteman, e eu sou Isaac Ky. Também sou do laboratório de michelon. Hoje gostaríamos de mostrar a vocês o procedimento básico para analisar grandes complexos proteicos aplicando espectrometria estrutural, e utilizamos este procedimento em nosso laboratório para caracterizar complexos proteicos, definindo sua geometria estequiométrica, composição e redes de interação. Então, vamos começar.

A análise de complexos proteicos ligados não correntes é realizada pela técnica de imunização por pulverização aérea, utilizando capilares emme plus ou a qua. Esse capilar C pode ser puxado até uma ponta fina de cerca de um micrômetro de diâmetro e, em seguida, revestido com um material condutor, como ouro. Esses capilares estão disponíveis comercialmente, como pode ser visto aqui.

No entanto, é muito mais econômico de usar. Os capilares de vidro, eh, que podem ser resfriados e revestidos até o estado pronto para uso, são resfriados neste dispositivo de agrupamento de agulhas e revestidos neste dispositivo de revestimento, eh. Para iniciar este procedimento, fixe duas tiras de uma almofada adesiva dupla face na parte inferior de uma placa de Petri, mantendo as tiras separadas por dois centímetros.

Coloque uma haste de vidro no centro de uma das almofadas. A almofada adesiva mantém os capilares no lugar e a haste de vidro sustenta os capilares preparados, evitando que as pontas dos capilares quebrem. Utilize capilares de vidro de borosilicato Boris com um milímetro de diâmetro externo e 0,78 milímetro de diâmetro interno.

Insira um capilar na agulha, acomode suavemente o capilar no lugar e ajuste sua posição para que fique no centro do filamento de aquecimento. Aperte levemente as braçadeiras até que os capilares fiquem firmes em ambas as extremidades. Puxe o capilar utilizando o programa predefinido mostrado aqui.

No entanto, lembre-se de que o processo de programação do puxador é um processo de tentativa e erro. Até que uma forma aceitável da ponta seja obtida, cada capilar puxado dá origem a dois capilares finalmente moldados. Remova os capilares puxados do instrumento e inspecione as pontas, descartando aqueles que estiverem deformados ou quebrados.

Use pinças de posicionamento rombas para colocar os capilares na placa de Petri. A base dos capilares fica presa ao suporte adesivo e a parte superior se apoia no bastão de vidro com a ponta voltada para cima. Continue puxando os capilares até que a placa de Petri esteja cheia.

Aproximadamente 80 capilares cabem em um prato de 10 centímetros de diâmetro. Em seguida, recubra os capilares com ouro. Insira a placa no aparelho de pulverização catódica de ouro.

Certifique-se de que a fonte de gás seja escolhida de acordo com as instruções do fabricante e ative um ciclo de revestimento predefinido. O revestimento é repetido de três a seis vezes até que os capilares fiquem uniformemente dourados. Uma vez que os capilares estejam prontos, prossiga para calibrar o espectrômetro de massas.

A maioria dos experimentos realizados em complexos MultiPro é conduzida por um espectrômetro de massas com eletrospray, quadrupolo e tempo de voo, como este. Fornecido pela Waters, foi modificado para massas elevadas. Antes de carregar a amostra proteica, calibre o espectrômetro de massas utilizando iodeto de césio.

Primeiro, prepare uma solução de 100 miligramas por mililitro de césio em água purificada. O césio é usado para calibração de alta massa, pois os aglomerados de sal monocarregados se estendem por uma ampla faixa de massa, de 393 da razão massa/carga até bem acima de 10.000. Usando pinças rombudas, pegue uma capilar revestida da placa de Petri e carregue dois microlitros da solução de césio na capilar.

Usando uma ponteira carregada com gel einor. Deslize a solução em direção à ponta da capilaridade, manualmente ou com o uso de um adaptador de centrifugação. Insira a capilaridade no suporte de capilaridade e ajuste-a de modo que a ponta fique aproximadamente a 10 milímetros da borda do suporte.

Coloque a capilaridade sob um microscópio óptico e use pinças finas do tipo AA para cortar a ponta. É importante verificar se não há bolhas de ar dentro da capilaridade que possam obstruir o fluxo e se a capilaridade não está entupida. Além disso, certifique-se de que o revestimento de ouro não foi removido da capilaridade.

Se for o caso, substitua a capilar ou corte a ponta e remova a seção não revestida. Em seguida, conecte o suporte da capilar ao interface ESI de fluxo nanométrico. Gire o estágio XY, Z para trás para evitar danificar a capilar e empurre o estágio para sua posição ativada.

O capilar deve ser posicionado a uma distância de um a dez milímetros do orifício do cone. Aplique tensão ao capilar e pressão de fluxo nano baixa até que a pulverização seja iniciada. Em seguida, tente reduzir a pressão de fluxo nano a um valor mínimo.

Otimize a intensidade do sinal ajustando a posição do estágio XYZ, a tensão da capilar, a pressão do fluxo nano e o fluxo de gás de dessolvatação. Para detectar uma ampla faixa de massa de séries de picos sazonais, as tensões de aceleração devem ser otimizadas. Os parâmetros utilizados aqui são capilar de 1,3 a 1,7 quilovolts, cone da amostra de 80 a 150 volts e cone de extração de um a três volts, para otimizar a transmissão de íons de alta massa, que exigem condições suaves de dessalização.

A pressão de contra-pressão é elevada para cinco a seis milibares na fase inicial de vácuo entre a fonte e o analisador. Para aumentar a pressão de contra-pressão, reduza cuidadosamente a condutância da linha de vácuo da fonte até a bomba espiral fechando parcialmente a válvula de isolamento, ao mesmo tempo em que monitora o efeito sobre a intensidade do sinal. Ao configurar completamente os espectrômetros de massa, colete cerca de 30 varreduras a uma varredura por segundo em uma faixa de razão carga-mestra entre 1000 e 15.000; após a aquisição, calibre o tempo de voo utilizando a tabela de calibração apropriada.

Agora que a calibração está concluída, a amostra proteica pode ser carregada. A amostra é preparada antes da calibração do espectrômetro de massas, sendo necessárias concentrações micromolares baixas. Se necessário, concentre a amostra utilizando dispositivos de ultrafiltração centrífuga.

Verifique se o complexo proteico não está absorvido na membrana do dispositivo antes do uso. Ao verificar o volume e a absorbância na UV, apenas soluções voláteis podem ser usadas na NESI, o que frequentemente torna necessária a troca de tampão. Uma coluna de filtração em gel de microcentrífuga pode ser utilizada para remover todos os vestígios de sais, moléculas de tampão ou quaisquer outros adutos não voláteis.

Em vez disso, suspenda a amostra em uma solução aquosa de acetato de amônio. Esta etapa crítica determina a qualidade dos espectros.

Repita a troca de tampão até três vezes com diluição mínima, menos de um fator de 1,3 por dispositivo, até que a troca máxima seja alcançada. Se forem necessárias tanto a concentração quanto a troca de tampão, estas podem ser realizadas simultaneamente utilizando ultrafiltração centrífuga, conforme mostrado no início desta seção. Em seguida, carregue a amostra conforme indicado para a calibração com iodeto de césio e inicie a pulverização.

Inicie com a otimização inicial da pulverização até que o sinal seja detectado. Utilize a equação para o estado de carga médio mostrada, na qual M é a massa do complexo. Em Daltons, no entanto, a posição exata dos estados de carga depende da proteína.

Para evitar a dissociação do complexo, não aqueça a fonte de ferro. Desligue o aquecedor ou mantenha a temperatura abaixo de 40 graus Celsius. Varie a posição da cápsula, do cone de amostra e das tensões do extrator.

Para maximizar a transmissão de íons, um possível ponto de partida é a tensão do cone, 100 volts no cone extrator, um volt e tensão de capilar de 1,5 quilovolts. Verifique a alteração resultante nos espectros. Otimize esses parâmetros em combinação com uma pressão de fluxo nano para melhorar a desolvatação e remover componentes residuais de água e tampão.

Aumente a tensão de polarização com a pressão do gás na célula de colisão. Tensões de polarização típicas estão na faixa de 10 a 100 volts, com um fluxo de gás de aprisionamento de um a 10 mililitros por minuto. Realize isso com cuidado para evitar a associação do complexo, ajustando as energias de colisão da armadilha e de transferência.

Normalmente, são necessárias tensões mais altas, geralmente na faixa de 10 a 30 volts, para a transmissão de íons de alta massa. Neste ponto, é importante evitar a dissociação induzida por colisão do complexo, conforme mostrado aqui. Após alcançar um sinal estável, recomenda-se que a pressão do fluxo nano e a tensão da capilar sejam reduzidas aos valores mínimos, mantendo ao mesmo tempo uma pulverização estável.

Após coletar vários espectros, prossiga para identificar os componentes do complexo por espectrometria de massas em tandem. Uma vez obtido um sinal ótimo e estável para o complexo proteico, selecione um íon precursor e defina o centro de massa na largura de isolamento. Geralmente, utilize uma resolução de massa baixa de 12 e uma resolução de massa alta entre 13 e 15, com um intervalo de massa amplo para detectar os produtos de dissociação de alta massa e baixa carga, e depois reduza-o para os valores desejados para realizar a ms.

A dissociação por MS do precursor de ferro é realizada aumentando a energia de colisão, abreviada como CE, e a pressão na célula de colisão; aumente gradativamente a CE do tipo armadilha ou transferência em etapas de 10 a 20 volts e eleve a pressão do gás de colisão de zero a cinco mililitros por minuto. Monitore as alterações nos espectros até que as condições ótimas de ativação sejam alcançadas. Uma energia de ativação elevada pode induzir a dissociação de uma ou mais subunidades a partir do complexo intacto e esclarecer as afinidades de interação entre diferentes subunidades.

Selecione mais de uma carga para a análise por espectrometria de massas (MS). No caso de componentes sobrepostos, adquirir um conjunto de espectros de MS em tandem auxilia na resolução da série de cargas das diferentes populações. Além disso, estados de carga mais altos se dissociam mais facilmente em comparação com estados de carga mais baixos, o que superpõe o MS e o ms.

Spectros de MS para validar o isolamento do íon precursor escolhido. Além da caracterização do complexo intacto por MS e MS/MS, realize a geração de subcomplexos menores em solução sob condições brandas de desnaturação e caracterize-os também.

A análise por espectrometria de massas (EM) e EM/EM de subcomplexos constitui a base para definir a arquitetura de subunidades do complexo. Para a desestabilização parcial de interações entre subunidades, adicione gradualmente solventes orgânicos até uma concentração de 50%, ou altere o pH da solução mediante adição de amônia ou ácido fórmico até uma concentração de 4%. Por fim, para determinar as massas das subunidades individuais que compõem o complexo, é importante obter o espectro em condições desnaturantes. Isso pode ser realizado utilizando um zip tip C4 com uma proporção de 25 a 75 de água e acetonitrila contendo 1% de ácido fórmico como solvente de eluição. Todos os dados coletados devem ser processados e os resultados analisados conforme detalhado no protocolo escrito que acompanha. Antes de carregar a amostra do complexo proteico, os espectrômetros de massas devem ser calibrados utilizando iodeto de césio.

A série de picos igualmente espaçados marcados em vermelho se estende por uma ampla faixa, desde uma razão de carga principal de 393 até bem acima de 10.000. Eles são atribuídos a aglomerados de sal com carga simples de composição geral do complexo cério mais. Sinais adicionais entre os picos principais marcados em preto são causados por espécies com carga dupla e tripla da série complexo cério dois mais e complexo cério três mais.

O aumento da pressão na fase inicial de vácuo é essencial para detectar os aglomerados de alta massa. O efeito da pressão sobre os picos de alta massa é demonstrado aqui com leituras de pressão de 1,2 e 5,3 milibar. O espectro de massa para a pressão mais elevada é mostrado expandido aqui.

Aqui está um exemplo de espectrometria de massas de um complexo de variante de lectina que gera uma distribuição de estados de carga entre 3000 e 5.000 razão massa/carga. No entanto, devido a uma dessalinização inadequada dos íons, os picos são largos. O aumento da tensão de polarização de quatro para 15 volts, o que provoca um aumento nas condições de aceleração, causa a remoção de água residual e componentes do tampão, resultando em um espectro altamente resolvido, cuja massa medida corresponde a um complexo pentamérico.

O estado de carga positivo 15 foi então selecionado para análise por espectrometria de massas em tandem. O aumento na energia de colisão provoca a liberação de um monômero altamente carregado centrado na razão carga/massa de 1.664 e de um complexo tetramérico desprovido na faixa de razão massa/carga de 5.000 a 8.000. O complexo da variante de lectina também foi examinado sob condições desnaturantes, levando à associação do complexo.

Dessa forma, pode-se determinar a massa exata das subunidades individuais que compõem o complexo. Acabamos de mostrar como adquirir espectros de MS e espectros em tandem de íons de alta massa. Ao realizar este procedimento, é importante preparar adequadamente a sua amostra e utilizar apenas tampões voláteis compatíveis com espectrometria de massas.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.