Um dispositivo micro para Quantificar Quimiotaxia bacteriana em gradientes de concentração estável

E. coli RP4-37 são introduzidas em um dispositivo de quimiotaxia onde são expostas a uma concentração espacial definida. Os gradientes aos quais as células estão expostas ao entrar na câmara encontram o ponto médio do gradiente de concentração. Dependendo de o sinal ser percebido como um atrativo ou repelente, as bactérias se movem rapidamente para cima ou para baixo ao longo do gradiente de concentração.

Olá, sou Derek Engler do Laboratório de Biotecnologia de Sistemas Moleculares e do Departamento de Engenharia Química da Universidade Texas A&M. Hoje vamos mostrar um procedimento para investigar o quimiotaxismo bacteriano em um dispositivo microfluídico. Utilizamos este procedimento em nossos laboratórios para estudar como o E. coli RP437 migra em um gradiente de concentração de sulfato de níquel.

Então vamos começar. A camada fluidica e a camada de controle são fabricadas por moldagem por replicação de Polymethyl SUBOXANE ou PDMS a partir do molde SU oito. Para iniciar este procedimento, misture o pré-polímero de PDMS e o agente de reticulação numa proporção de 10 para 1 em peso.

Desgasifique a mistura em um dessecador por uma hora, até que as bolhas de ar sejam removidas. Quando a mistura de PDMS estiver pronta, coloque o molde SU oito em uma placa de Petri e despeje cuidadosamente a mistura sobre o molde SU oito até a espessura desejada. Aqueça a placa de Petri contendo o PDMS e o molde SU oito a 80 graus Celsius por duas horas para curar o PDMS.

Após duas horas, remova da placa aquecida o SU-8 mestre revestido com PDMS curado e desprenda o molde de PDMS do mestre SU-8. A estrutura desejada ficará embutida no molde de PDMS; utilize uma agulha romba de calibre 20 para perfurar quatro orifícios no molde de PDMS, destinados à tubulação para o gerador de gradiente, entrada celular e saída celular. Agora estamos prontos para montar o dispositivo de PDMS e selar o dispositivo de PDMS.

Primeiro, limpe uma lâmina de microscópio de vidro com isopropanol e seque-a com um jato de ar. Em seguida, exponha o molde de PDMS e a lâmina de vidro ao plasma de oxigênio em um atacador a plasma por cerca de 30 segundos. Coloque o molde de PDMS em contato com a lâmina de vidro. Aqueça a lâmina e o molde de PDMS em contato a 65 graus Celsius em uma placa aquecedora por 15 minutos.

Para montar o dispositivo de PDMS, use uma lâmina de barbear para cortar a tubulação em um ângulo de 45 graus no comprimento correto necessário, dependendo da configuração do microscópio. Em seguida, usando pinças, insira uma extremidade da tubulação em um dos quatro orifícios perfurados no dispositivo.

Insira a extremidade romba da agulha de calibre 30 na outra ponta do tubo. Repita a inserção do tubo e da extremidade da agulha em todos os orifícios restantes. Carregue um mililitro de quimiotáticos, tampão ou CB em uma seringa de três mililitros.

Cuidado para remover o ar da seringa. Adicione CB à conexão da agulha de saída usando uma pipeta e bata suavemente na conexão para remover quaisquer bolhas de ar. Expulse um pouco de CB pela ponta da seringa de três mililitros e conecte a seringa à conexão da agulha sem aprisionar ar.

Empurre o CB através do dispositivo até que todas as conexões restantes da agulha estejam preenchidas com CB. Isso deve remover a maioria das bolhas de ar. Em seguida, encha duas seringas de 500 microlitros com CB contendo as concentrações apropriadas do efetor químico que está sendo testado.

Elimine a formação de bolhas de ar expulsando uma pequena gota do conteúdo da seringa e tocando as gotas do líquido no conector da agulha, e fixe a seringa para preparar bactérias altamente móveis. Para o experimento de quimiotaxia, cultive uma cultura de E. coli RP437 com expressão de GFP, contendo um plasmídeo, em caldo tripton ou TB a 32 graus Celsius com agitação, no dia seguinte. Use a cultura de crescimento noturno para inoculação de uma cultura de 20 mililitros de TB em um frasco erlenmeyer de 250 mililitros até uma densidade óptica a 600 nanômetros de aproximadamente 0,05.

Cultive a cultura a 32 graus Celsius com agitação quando as células apresentarem uma OD 600 de aproximadamente 0,35 a 0,45. Recolha-as por centrifugação de baixa velocidade e ressuspenda as células até uma OD 600 de cerca de 0,35 em CB contendo o efetor químico na concentração esperada no centro do canal. Por fim, adicione células mortas marcadas com RFP a uma OD 600 de aproximadamente 0,35 às células vivas que expressam GFP.

Essas células mortas servirão como controle interno para garantir que qualquer migração não seja devida a efeitos de fluxo. A suspensão celular está agora pronta para ser carregada no dispositivo microfluídico para o experimento de quimiotaxia. Para iniciar o experimento de quimiotaxia, remova parte do CB da agulha de entrada celular e reabasteça com a suspensão celular.

Encha cuidadosamente uma seringa de 50 microlitros com as células ressuspendidas. Faça isso lentamente, pois os flagelos podem ser rompidos, o que reduzirá a motilidade. Conecte a seringa de 50 microlitros ao alojamento da agulha de entrada conforme mostrado anteriormente, expulsando uma pequena gota do conteúdo da seringa e tocando a gota ao líquido no alojamento da agulha; em seguida, conecte a seringa e posicione o dispositivo na platina de um microscópio de fluorescência equipado com uma câmera de alta velocidade para aquisição de imagens.

Coloque ambas as seringas de entrada na bomba de seringa e inicie o fluxo de modo que o gradiente seja formado e as células fluam através da tubulação. Assim que as células entrarem na câmara de quimiotaxia, aguarde cerca de 20 minutos para que o sistema se estabilize. Antes da aquisição de imagens, colete imagens de fluorescência verde (vivas) e vermelha (mortas) em tempo real em diferentes posições ao longo do comprimento da câmara.

Tipicamente, coletamos 100 imagens em cada localização com intervalos de três segundos. As imagens de fluorescência adquiridas podem ser analisadas usando qualquer programa de análise de imagens disponível comercialmente, como Image J ou Metamorph, ou utilizando códigos simples escritos em MATLAB. Neste exemplo, usaremos códigos em MATLAB.

Inicie removendo os pixels de fundo na imagem por meio desse valor definido de intensidade de pixel, e elimine todos os pixels que possuem intensidade inferior ao limiar. Isso minimiza o ruído. Na análise, utilize a posição das células mortas para determinar o centro da imagem.

Esta é a posição onde as células entraram na câmara de quimiotaxia e onde seriam detectadas na ausência de qualquer migração. Em seguida, localize as células vivas na imagem, divida a imagem em canais e determine o número de células vivas em cada canal. Em nosso trabalho anterior, a câmara de quimiotaxia com largura de 10 a 50 micrômetros foi dividida em 64 canais, cada um com cerca de 16 micrômetros de largura.

Após repetir essas etapas para todas as imagens, some as contagens totais de células para cada canal em todas as imagens. Isso fornece a contagem total de células detectadas em cada canal ao longo da duração do experimento. Calcule o quimiotax, coeficiente de partição ou CPC, que representa a direção da migração.

Ao executar os seguintes passos, atribua um multiplicador de mais um e menos um a cada célula localizada nos lados de alta concentração ou direito e de baixa concentração ou esquerdo das células mortas, respectivamente. Some todos os valores multiplicados e normalize pelo número total de células detectadas. Calcule a quimiotaxia, o coeficiente de migração ou CMC, que pondera a migração das células pela distância percorrida.

Uma célula que se move para o canal da posição de maior concentração, 64, recebe um fator de ponderação de mais um, enquanto uma célula que se desloca até a metade do lado de maior concentração recebe um fator de ponderação de mais 0,5. Uma célula que se move para a posição de menor concentração mais distante é ponderada com menos um. A soma de todas as contagens ponderadas de células é normalizada pelo número de células para gerar o CMC.

Este gráfico mostra um gradiente de concentração linear ou perfil formado no dispositivo microfluídico utilizando isotiocianato de fluoresceína. A formação de um gradiente de concentração é demonstrada nesta figura usando corantes azul e amarelo. A entrada celular foi CA para que não houvesse fluxo através dela, e pode-se observar que uma faixa de cores entre azul e amarelo é formada.

Aqui estão imagens em pseudocores de um experimento representativo de quimiotaxia no qual E. coli RP437 foi exposta a um gradiente de zero a 100 micromolares de L-aspartato ou de zero a 225 micromolares de sulfato de níquel no dispositivo. A migração de bactérias verdes vivas em direção ao L-aspartato ou afastando-se do níquel foi registrada a cada 2,5 segundos durante 30 minutos. Bactérias mortas, mostradas em vermelho, serviram como controle para os efeitos de fluxo no dispositivo.

A distribuição espacial do RP 4 37 no dispositivo microfluídico na ausência de um gradiente é mostrada neste gráfico, em comparação com sua resposta a um gradiente de aspartato e a um gradiente de sulfato de níquel. Acabamos de mostrar como monitorar as quimiotaxes do E. coli RP 4 37 em um gradiente de sulfato de níquel. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de minimizar a agitação turbilhonar das células para que uma subpopulação altamente móvel possa ser utilizada.

Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.