Um dispositivo de geração de Gradient microfluídicos de Biologia Celular

Meu nome é Jiang. Sou pesquisador pós-doutorando em Harvard e no MIT Health, Ciência e Tecnologia. E meu nome é Amir Manchi e sou aluno de graduação no laboratório do professor ha SANE, em Harvard, MIT, divisão de Ciências da Saúde e Tecnologia.

Este slide mostra o processo esquemático de como fabricar o dispositivo: primeiro, aplica-se 50 SUA de revestimento por centrifugação sobre o vapor de silicone e, em seguida, coloca-se uma máscara adicional sobre o vapor de silicone. Após isso, realiza-se a exposição UV e o desenvolvimento. Finalmente, é possível obter e colocar esses contatos sobre o vapor de silicone. Depois disso, pode-se simplesmente moldar o PDMS, seguido de rastejamento e aquecimento, e fazer um pequeno furo. Em seguida, pode-se unir o dispositivo de PDMS ao vidro de quartzo utilizando plasma de oxigênio.

Ok, estamos agora na sala de microfabricação dentro do laboratório e vamos começar produzindo algumas camadas de PDMS. Quando me refiro a PDMS, o termo científico real é polidimetilsiloxano, e é um polímero orgânico. É o polímero orgânico à base de silício mais amplamente utilizado.

Na verdade, é uma mistura de duas coisas diferentes: uma base de elastômero de silicone e um agente de cura de elastômero de silicone. A proporção é de 10 partes de base para 1 parte de agente de cura. Precisamos de cerca de 10 gramas de base e, consequentemente, de cerca de 1 grama de agente de cura de elastômero, e tentarei misturar bem a base com o agente de cura.

Vou usar pipetas. Agora que a mistura está pronta, vou despejá-la sobre a pastilha de silício. A ideia é que essas pastilhas de silício tenham alguns padrões em sua superfície.

Eles realmente ajudam esse polímero de PDMS a obter o padrão, e utilizamos esses padrões para criar canais, ranhuras ou qualquer outro padrão necessário nesses polímeros. Portanto, o próximo passo é, como temos muitas bolhas dentro dessa mistura, colocá-la sob vácuo para evitar a presença de bolhas no nosso polímero. Vou colocar os géis de PDMS sobre a lâmina de silício dentro da câmara de vácuo.

Vou fechar a câmara e vou abrir o vácuo. Depois que as bolhas desaparecerem, talvez em cerca de alguns minutos, vamos colocá-lo dentro do forno durante a noite, o que equivale a cerca de 70 graus Celsius, e isso fará com que solidifiquem. O padrão ao qual quero que você preste atenção são essas três câmaras diferentes, a fim de criar gradientes, de modo que tenhamos concentração zero em um lado e uma quantidade específica de concentração neste outro lado, avançando uniformemente em direção a ela, e faremos uma pequena perfuração na outra extremidade, que será nossa saída neste caso.

O próximo passo é cortar um desses padrões e transferi-lo para uma placa de Petri, com as superfícies do padrão voltadas para cima. Espero que vocês consigam ver as três entradas e uma saída que expliquei nesses padrões. Usaremos perfuradores pequenos para as entradas, a fim de poder utilizar tubos de polietileno, e usarei perfuradores maiores para a saída, a fim de ter uma reserva de fluxo.

Então, vamos começar com a primeira entrada. Vou fazer uma perfuração, a mesma coisa com a segunda e também outra perfuração pequena para a terceira. O último passo é fazer uma perfuração grande na saída.

Então, uma vez concluído, teremos a camada A-P-D-M-S, que é a camada superior, e vou utilizar outra camada de vidro na parte inferior. Esses microslides serão minha camada inferior nos dispositivos microfoliculares. Agora estamos na sala de microfabricação e tenho uma camada de vidro e uma de PDMS, e quero uni-las uma à outra.

O que vamos usar agora é uma máquina chamada limpadora de plasma. O que acontecerá dentro da câmara é que o plasma ajudará a quebrar o equilíbrio superficial fraco e a substituí-lo por grupos químicos altamente reativos, e também a superfície se tornará hidrofílica. O que vai acontecer agora é que vou pegar o molde de PDMS, que era a camada superior e tinha alguns canais internos, e vou remover a fita que coloquei anteriormente para evitar que poeira adere ao nosso molde.

Vou colocá-lo dentro da câmara. A próxima etapa é que tenho uma camada de vidro, que é uma lâmina de microscópio, e esta será nossa camada inferior dentro do dispositivo. Então, vou colocar esta também dentro da câmara.

E fecho completamente a câmara, primeiro desligando a energia e depois a bomba, e então precisamos voltar a esta máquina daqui a cerca de cinco minutos. O que farei é desligar a máquina. Então, desligo primeiro a bomba e depois a energia, e abrirei a câmara.

Esse som é na verdade devido à pressão negativa que foi aplicada durante o processo dentro da câmara. Então, vou retirar as diferentes camadas e quero uni-las. Como o vidro é a camada inferior, vou segurá-lo com a mão esquerda e mantê-lo fixo, e pegarei a camada de PDMS para colocá-la sobre a camada de vidro.

Mas como, na verdade, os padrões estão voltados para cima no momento, vou inverter um pouco a camada de PDMS. Vou colocá-la sobre o vidro após pressioná-los juntos. Eles aderem com muita facilidade, e parte da vantagem desse processo de tratamento com plasma é a força adesiva e a permanência.

É assim que fica no final. Então, mais uma vez, estas são nossas entradas e esta é a minha saída, e estamos prontos para passar para a próxima etapa. Cozinhar a fibra dentro do dispositivo e depois colocar no incubador por uma hora, em seguida, retirar uma amostra SIM do incubador após uma hora, adicionar o alimento para cultivo de peixes e então preparar a solução.

Para preparar a solução de EGF, colocamos simplesmente dois mililitros de meio de cultura, assim como colocamos 15 nanogramas por mililitro de EGF e 10 micromolares de 50 D; essa solução é bastante difícil de visualizar para observar o gradiente de EGF ao longo do canal. Em seguida, adicionamos dois mililitros de meio, meio virtual, e colocamos aqui outros dois mililitros de meio. Esses dois compartimentos contêm apenas culturas normais, infusão normal de cultura normal no dispositivo.

Então eu removo a bolha, conecto novamente, esta também é uma bolha móvel M descendo novamente. Em seguida, uso apenas 15 nanogramas de EGF e 10 micromolares de fi dextra e dois mililitros de meio do material retirado, a amostra, coloco na seringa e então você sabe, a bolha. E depois apenas troco a solução, volto novamente.

A solução é aspirada na seringa de gás e empurra-se a alavanca SH várias vezes para remover as bolhas. Primeiro, toda a solução das seringas de troca é coletada aqui, depois a alavanca é acionada e a solução passa pela válvula de três vias, pela tubulação e sai pela extremidade do tubo. Após a mistura, quando a solução começar a sair, basta inserir o tubo no dispositivo My Predict. As três soluções são idênticas. Pode-se conectar suavemente a entrada do canal de infusão.

Então, finalmente, dois são meios de cultura normais. Um é o meio de cultura com EGF, para confirmar o perfil do gradiente de EGF. Este aqui é a célula na rede, célula na rede.

Isso irá à saída da célula, de modo a gerar um gradiente utilizando o canal de três hubs e, em seguida, gerar o gradiente dentro da área celular. Normalmente, o que quero fazer é apenas realizar o assentamento celular, suspensão celular, colocar a saída, e então podemos succionar suavemente a rede, fazendo com que as células fluam pela área celular, assentando-se automaticamente e se acomodando, garantindo que as células se espalhem completamente. Após verificar que as células estão completamente espalhadas, podemos iniciar a infusão e, então, estudar a migração celular utilizando o dispositivo gerador de gradiente.