Decifrando Pathways Axonal dos Grupos geneticamente definidos de neurônios no tubo Neural Utilizando Pintainho In ovo Eletroporação
2 de maio de 2010
Este vídeo demonstra como visualizar caminhos axonal de grupos geneticamente definido de neurônios na medula espinhal utilizando pinto embrionárias In ovo Eletroporação de genes repórter sob o controle de elementos específicos enhancer.
Olá, sou Ham do laboratório da Dra. Review Klar do departamento de neurobiologia médica da Universidade Hebraica de Jerusalém. Olá, sou Sophie Esman e também sou do laboratório Lars. Hoje vamos mostrar um procedimento para Innovo, eletroporação e preparação da medula espinhal em livro aberto.
Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar as trajetórias axonais de populações neuronais geneticamente definidas na medula espinhal embrionária. Vamos começar. Para iniciar este procedimento, transfira ovos de galinha brancos Leghorn fertilizados da temperatura ambiente para uma incubadora umidificada, preferencialmente com bandejas oscilantes, a 37-38 °C.
É importante monitorar a temperatura e a umidade da incubadora para obter embriões viáveis e sincronizados. Os embriões de pintinho são eletroporados quando atingem o estágio de Hamburger e Hamilton (HH) 18 a 20, que é um estágio ideal para a expressão específica dependente de enhancer. Neste estágio, a cabeça encontra-se em ângulo reto em relação ao tronco.
Também no estágio HH 18 a 20, um amplo conjunto de vasos sanguíneos extra-embrionários, como os vasos das linhas vitelinas anterior, posterior, direita e esquerda, também deve ser visível. Os embriões de pintinho atingem o estágio HH 19 a 20 após 66 horas de incubação, e nesse momento remova os ovos do incubador. Após remover os ovos, coloque-os na posição horizontal e aguarde de cinco a dez minutos. O embrião encontra-se agora no polo superior do ovo.
Antes da eletroporação, prepare os embriões com solução de Hank contendo 100 unidades por mililitro de penicilina e 0,1 miligramas por mililitro de estreptomicina. Prepare uma mistura desejada de DNA a duas a cinco microgramas por microlitro e adicione alguns grânulos do corante verde rápido para facilitar a visualização do DNA injetado. Tenha também prontos um pipetador bucal, uma agulha de seringa estéril, tesoura pequena e uma fita.
Prepare microcapilares puxando capilares de vidro com diâmetro de 0,5 milímetro utilizando um puxador de pipetas. Coloque os eletrodos de tungstênio nos micromanipuladores e conecte os eletrodos ao gerador de pulsos. Ajuste a voltagem no gerador de pulsos para menos 30 volts, a duração de cada pulso para 50 milissegundos e o número de pulsos para três.
Prossiga para a eletroporação antes de expor e manipular os embriões. Insira uma seringa no polo estreito do ovo e remova de cinco a seis mililitros de albúmina de cada ovo. A albúmina é removida para evitar que entorne.
Ao cortar na próxima etapa, use a tesoura pequena para cortar. Abra uma janela oval no lado superior do ovo após expor o embrião de pintinho e umedeça-a com 0,5 a um mililitro de solução de Hanks e penicilina-estreptomicina. Em seguida, use um pipetador de boca para carregar a micropipeta de vidro.
Com uma mistura de corante de DNA, uma microcapilar de diâmetro adequado deve ser facilmente carregada com DNA. Sob uma posição binocular, posicione o embrião para injetar o DNA no tubo neural. Coloque o embrião com a cauda voltada para você.
Nesta fase de desenvolvimento, a medula espinhal é claramente visível e, portanto, nenhuma técnica de contraste é necessária. A medula espinhal está fechada tanto na extremidade cefálica quanto na caudal. No entanto, com as punções de microcapilares, mais um orifício no tubo neural e penetrando-o em um ângulo raso, um microcapilar suficientemente fino e com o diâmetro correto deve penetrar no tubo sem danificá-lo.
Injete o DNA utilizando um micropipetador de boca. Uma micropipeta com o diâmetro correto deve liberar o DNA com uma expiração regular. A coloração verde deve se espalhar desde a ponta da cauda até as vesículas do cérebro em desenvolvimento.
Injete até que o tubo neural esteja cheio com DNA. A eletroporação é necessária para que o DNA injetado entre nas células primeiro. Posicione os eletrodos paralelamente ao tubo neural e o mais próximo possível dele, sem tocá-lo diretamente. Certifique-se de que os eletrodos estejam cobertos com líquido para permitir a condutividade elétrica durante o pulso.
Normalmente, a solução de Hank adicionada imediatamente após a exposição do embrião é suficiente. Porém, se necessário, adicione uma gota da solução de Hank logo antes do pulso, com os eletrodos posicionados e submersos no líquido, para realizar a eletroporação. Em seguida, remova cuidadosamente os eletrodos e feche a janela e o ovo com fita adesiva. É importante selar completamente o ovo para evitar a dessecação do embrião durante o período subsequente de incubação.
Coloque o ovo de volta no incubador e incube até que o embrião de pintinho atinja o estágio embrionário seis, ou E seis, quando for o momento da aquisição de imagens. Quando o embrião eletroporado atingir o estágio embrionário seis (E seis), três dias após a eletroporação, remova-o do ovo e coloque-o em uma placa de Petri revestida com silicone contendo PBS, utilizando uma tesoura fina.
Retire as membranas e estique o embrião em seu lado ventral usando alfinetes fixados na silicone para mantê-lo no lugar. Usando uma microcapilar de tungstênio afiada, faça uma incisão longitudinal ao longo da placa do teto, desde o cérebro posterior até a cauda.
Realize mais duas incisões longitudinais em ambos os lados da medula espinhal, destacando os gânglios da raiz dorsal ou DRGs da medula espinhal. Desprenda a lâmina basal do tecido começando pela cauda até o cérebro posterior, mantendo a medula espinhal intacta. Por fim, use tesoura fina para cortar a medula espinhal em secção transversal no cérebro posterior e separe a medula espinhal do corpo.
Agora que a medula espinhal foi isolada, espalhe-a em um novo recipiente de Petri revestido com silicone contendo PBS, utilizando pinos para fixá-la desde o cérebro posterior até a cauda, produzindo uma preparação em montagem plana. Fixe a medula espinhal em paraformaldeído 4% em PBS por uma hora à temperatura ambiente, seguido de coloração imunológica conforme o procedimento de imunohistoquímica, detalhado no protocolo escrito acompanhante, para montar a medula espinhal aberta. Prepare o espécime para aquisição de imagens.
Espalhe graxa ou silicone em formato retangular sobre uma lâmina e coloque uma gota de PBS dentro do retângulo. Use pinças para posicionar a medula espinhal, esticando-a no centro do retângulo, e remova o líquido ao redor. Com um bastão de aplicação, coloque uma a duas gotas de meio de montagem sobre a medula espinhal e cubra com uma lamínula.
Aplicar pressão sobre a lamínula. Para evitar bolhas de ar. Manter as lâminas no escuro a quatro graus Celsius.
Inspecione a medula espinhal utilizando microscopia confocal. Abaixo estão alguns resultados representativos de rejeições axonais de interneurônios espinhais de pintinho em experimentos controle, nos quais RFP é expressado em todos os neurônios por meio de um elemento potenciador ubíquo do CMV; a maioria dos neurônios e seus axônios está marcada. É impossível decifrar o trajeto axonal de subpopulações neuronais.
No entanto, ao aplicar elementos potencializadores específicos, é revelado um trajeto axonal definido de uma subpopulação específica de dois neurônios neste exemplo. Assim, acabamos de mostrar como eletroporar um tubo neural de face com um potenciador neuronal específico no estágio E três e como preparar uma medula aberta em formato de livro no estágio E seis. Ao realizar este procedimento, você deve lembrar-se de ser cuidadoso e paciente.
Então é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos. Boa sorte.
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Visão Geral
Este vídeo demonstra um procedimento para visualizar trajetos axonais de neurônios geneticamente definidos na medula espinhal de embriões de galinha, utilizando eletroporação in ovo. O método permite que pesquisadores estudem efetivamente as trajetórias axonais.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia do Desenvolvimento
- Eletrfisiologia
Contexto
- Compreender as vias axônicas é fundamental para a pesquisa em neurociência.
- A eletroporação in ovo é uma técnica utilizada para introduzir genes repórter.
- A medula espinhal embrionária de pintinho serve como modelo para o estudo do desenvolvimento neuronal.
- Populações neuronais geneticamente definidas podem fornecer insights sobre circuitos neurais específicos.
Objetivo do Estudo
- Para visualizar as vias axonais na medula espinhal embrionária.
- Para utilizar a eletroporação in ovo em estudos de expressão gênica.
- Para aprimorar a compreensão do desenvolvimento neuronal e da conectividade.
Métodos Utilizados
- Transfira ovos de galinha fertilizados para uma incubadora umidificada.
- Mantenha a incubação a 37 a 38 graus Celsius.
- Realize a eletroporação in ovo para introduzir genes repórter.
- Prepare preparações de livro aberto da medula espinhal para visualização.
Resultados Principais
- Visualização bem-sucedida de vias axonais na medula espinhal.
- Demonstração da eficácia da eletroporação in ovo.
- Informações sobre as trajetórias de populações neuronais definidas geneticamente.
- Estabelecimento de um método confiável para estudar o desenvolvimento neuronal.
Conclusões
- O método fornece uma ferramenta valiosa para a pesquisa em neurociência.
- A eletroporação in ovo é eficaz para a entrega de genes em modelos embrionários.
- Compreender as vias axonais pode contribuir para estudos sobre a formação de circuitos neurais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite a visualização precisa das trajetórias axonais em populações neuronais geneticamente definidas, abordando um desafio fundamental na validação de alvos, onde a marcação bilateral obscurece as projeções ipsilaterais versus contralaterais. Ao restringir a expressão do repórter a um único lado do tubo neural por meio da eletroporação unilateral in ovo, os pesquisadores conseguem reduzir mecanicamente os riscos associados a hipóteses sobre circuitos neuronais já nos estágios iniciais da descoberta. A abordagem reforça a confiança preditiva na seleção de alvos ao esclarecer padrões de conectividade específicos de vias relevantes para modelos de doenças neurodesenvolvimentais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao isolar as projeções axonais de subpopulações neuronais específicas definidas por repórteres acionados por enhancer.
- Valor Operacional: Fornece marcação unilateral para distinguir axônios com projeções ipsi e contralaterais, reduzindo ambiguidades no mapeamento de circuitos.
- Valor Preditivo: Apoia a desmistificação biológica de alvos ao esclarecer se uma população neuronal ativa vias excitatórias ou inibitórias cruciais para o mecanismo da doença.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Gera dados quantificáveis de trajetória axonal como leitura fenotípica para triagem de moduladores genéticos ou farmacológicos da orientação neuronal.
- Valor Operacional: Produz preparações padronizadas e reprodutíveis em montagem inteira, compatíveis com imagens confocais de alta resolução e pipelines automatizados de análise.
- Valor de Escalabilidade: Utiliza o modelo de embrião de galinha, passível de escalonamento para testes multicondicionais de atividade de enhancer ou eficiência de eletroporação.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Translacional: Mapeia vias axonais relevantes para doenças em modelos de medula espinhal de vertebrados, permitindo o alinhamento com biomarcadores humanos de transtornos neurodesenvolvimentais.
- Continuidade Mecanística: Conecta a validação de alvos em fase de descoberta com a avaliação pré-clínica de efeitos de fármacos no nível de circuitos sobre o crescimento ou orientação axonal.
- Avanço Ajustado ao Risco: Orienta decisões de prosseguir ou não ao revelar se um alvo modula padrões específicos de projeção associados à recuperação funcional ou à patologia.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se no continuum de descoberta, desde a geração de hipóteses sobre alvos até a identificação de compostos iniciais, fornecendo insights mecanicistas que antecedem o desenvolvimento de ensaios funcionais e apoiam o alinhamento de biomarcadores translacionais.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a expressão gênica específica de enhancers na definição de subpopulações neuronais e suas trajetórias axonais.
- Triagem: Permite sistemas biológicos prontos para ensaios, com expressão padronizada e unilateral de repórteres, para avaliação dos efeitos de compostos sobre o direcionamento axonal.
- Análises: Fornece leituras espaciais quantitativas dos padrões de projeção axonal, facilitando comparações entre condições genéticas ou de tratamento.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se ao trabalho pré-clínico ao estabelecer modelos de vias axonais relevantes para doenças, permitindo a correlação com biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para testes iterativos de construtos genéticos, elementos enhancer ou parâmetros de eletroporação em múltiplos alvos neuronais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao resolver a direcionalidade das projeções axonais, um fator crítico na avaliação de efeitos de fármacos específicos para circuitos neurais.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e a padronização por meio de parâmetros definidos de eletroporação (tensão, duração do pulso, número) e manipulação estagiada de embriões.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a eliminação precoce de alvos cujas vias axonais não estão alinhadas com os mecanismos terapêuticos desejados.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao identificar alvos que modulam padrões específicos de projeção relevantes para desfechos clínicos em indicações neurodesenvolvimentais.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em técnicas embriológicas, incluindo estadiamento de embriões, microinjeção e otimização de parâmetros de eletroporação.
- Depende de instrumentação como geradores de pulso, micromanipuladores, eletrodos de tungstênio e microscopia confocal para imageamento.
- Necessita padronização da concentração de DNA, seleção de elementos reguladores e posicionamento dos eletrodos entre diferentes usuários e laboratórios para resultados reprodutíveis.
- Envolve considerações de adaptação ao transferir o modelo para outros sistemas vertebrais ou tipos neuronais além dos interneurônios espinais.
- Limitações práticas incluem a viabilidade embrionária sensível às condições de incubação e o desafio técnico de obter eletroporação unilateral uniforme sem danos ao tubo neural.
