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2 de março de 2010
O electroolfactogram gravação (EOG) é uma maneira informativa de fácil condução e confiável de avaliação da função olfativa ao nível do epitélio olfativo. Este protocolo descreve uma configuração de gravação, de preparação dos tecidos mouse, coleta de dados e análise de dados básicos.
Uma preparação de epitélio olfativo é montada em uma placa e colocada em um fluxo de ar umidificado. Sob um microscópio estereoscópico, um eletrodo de referência é conectado eletricamente ao tecido por meio de uma solução tampão. Um eletrodo de gravação é posicionado sobre a superfície do epitélio olfativo.
O epitélio olfativo é estimulado por rajadas de odoríferos controladas por computador, administradas em um fluxo de ar umidificado, que transporta os odoríferos até o epitélio olfativo. Os sinais de EOG são transmitidos por meio de um amplificador e um digitalizador até o computador de gravação. Olá, sou Catherine Ciar do Laboratório de Higiene XO do Departamento de Biologia da Universidade Johns Hopkins.
Hoje vamos mostrar um procedimento para registrar o eletroolfatograma de camundongos. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar as respostas dos neurônios sensoriais olfativos a odores. Então, vamos começar.
O aparato de gravação é composto por um eletrodo de gravação, eletrodo de referência, tubo de entrega de ar, estágio para o espécime e microscópio estereoscópico, todos fixados sobre uma mesa pneumática dentro de uma gaiola de Faraday. Micromanipuladores são utilizados para posicionar os eletrodos no tubo de entrega de ar. Uma corrente contínua de ar é borbulhada através de água destilada para adicionar umidade antes de passar pelo tubo de entrega de ar e sobre o espécime.
Uma placa de cultura de 60 milímetros preenchida com sard para adaptação de seis a oito milímetros é usada como superfície de montagem para o espécime. Um poço e um canal são escavados nesse suporte na placa de montagem. Para fornecer um meio de conectar eletricamente o eletrodo de referência ao espécime por meio de solução de Ringer modificada.
Os eletrodos de gravação e de referência são conectados a um amplificador. Os sinais provenientes do amplificador são enviados a um digitalizador e depois a um computador. O software XI Graph é utilizado para controlar o protocolo de estimulação, registrar o sinal e analisar as respostas.
Um osciloscópio é conectado após o amplificador para monitoramento em tempo real do potencial elétrico durante a colocação do eletrodo de gravação e também durante as gravações de EOG. A aplicação dos estímulos odoríferos é controlada por um pico spritzer, que é conectado ao mesmo computador utilizado para a aquisição de sinais, logo antes da aplicação de um estímulo odorífero.
A saída do pulverizador pico é conectada a um frasco contendo odorizante líquido. O frasco é então conectado ao tubo de fornecimento de ar. Agora vamos ver como preparar os eletrodos para experimentos de gravação.
O eletrodo de gravação é um fio de prata cloreto em uma capilar de vidro puxada, preenchida com solução de Ringer modificada. O eletrodo de referência é um fio de prata cloreto. Inicie a preparação de ambos os eletrodos instalando um fio de prata no suporte do eletrodo.
Para o eletrodo de gravação, um a dois centímetros de fio devem protruir da extremidade do suporte do eletrodo. Pode-se deixar mais fio para o eletrodo de referência. Para adicionar o revestimento de cloreto de prata, posicione o fio em cloreto de sódio 0,1 molar e conecte o suporte do eletrodo ao terminal positivo de uma fonte de alimentação CC de 1,5 a nove volts.
O terminal negativo da fonte de alimentação deve ser conectado eletricamente à solução de cloreto de sódio 0,1 molar. Deixe a reação com o cloreto prosseguir por 10 minutos para equalizar qualquer carga estática entre o eletrodo de gravação e o eletrodo de referência. Toque brevemente os eletrodos um no outro antes de instalá-los no aparelho de gravação.
Em seguida, puxe uma capilar de vidro utilizando um puxador de micropipetas. A abertura na ponta da capilar deve ter cerca de cinco a 10 micrômetros de diâmetro. Use um lápis de diamante para riscar e quebrar a extremidade romba da capilar, de modo que ela fique cerca de dois centímetros mais longa que o fio de prata.
Use uma tocha de butano para polir com fogo a extremidade cortada e agora derreta 0,5% de agros em solução de Ringer modificada. Use uma pipeta de transferência para puxar uma pequena quantidade da solução fundida de agro para a ponta do eletrodo, utilizando uma seringa que foi aquecida e puxada para ter uma extremidade longa e fina. Encha a capilar puxada até cerca de metade da sua capacidade.
Com a solução de Ringer modificada, agite suavemente o capilar para desprender quaisquer bolhas de ar. Armazene o eletrodo preenchido no frasco de armazenamento com uma pequena quantidade de solução de Ringer modificada no fundo até o momento de uso. Uma vez que uma amostra de tecido esteja preparada e pronta para gravação, instale um capilar cheio sobre o fio do eletrodo de gravação com os eletrodos prontos.
Vamos analisar um experimento de gravação para começar a preparar o tecido para a gravação. Remova a pele que recobre o crânio de um camundongo sacrificado e, em seguida, bisseque cuidadosamente a cabeça ao longo da linha média, montando uma metade da cabeça com o lado medial voltado para cima no recipiente de montagem. Remova cuidadosamente o septo para expor os cornetos.
Coloque a placa com o tecido montado sobre a plataforma de gravação. Alinhe a plataforma para que o local de gravação nos cornetos fique centralizado sob o microscópio. Agora ligue o tanque de ar para fornecer ar umidificado a aproximadamente 600 mililitros por minuto à superfície do corneto.
Posicione o tubo de fornecimento de ar de modo que fique a aproximadamente 10 milímetros de distância do local de gravação. Configure o amplificador no modo CC, pois a amplificação CA induzirá artefatos no sinal de EOG. Adquira com um filtro passa-baixa de um quilohertz e ganho de 100 x.
Agora, fixe os eletrodos de gravação e de referência nos micromanipuladores. Abaixe o eletrodo de referência até o poço no recipiente de montagem e cubra-o com solução de Ringer modificada, de modo que fique eletricamente conectado ao tecido. Abaixe cuidadosamente o eletrodo de gravação até a superfície da concha dois B ou três.
O eletrodo deve tocar levemente a superfície do epitélio olfativo. Quando o eletrodo entrar em contato com o epitélio, uma linha de base reta aparecerá no osciloscópio. Agora, conecte um frasco de odorífero à porta lateral do tubo de fornecimento de ar no computador.
Inicie um protocolo de estimulação. A taxa de amostragem para a aquisição de dados deve ser de dois quilohertz ou superior. O software acionará um pulso de odor e iniciará a gravação.
Um protocolo típico de estimulação pode ser um pulso único de duração de 100 milissegundos, pares de pulsos de 100 milissegundos separados por um intervalo de um segundo ou um pulso sustentado de dez segundos. Para minimizar a adaptação, aguarde de um a cinco minutos entre os protocolos após a aplicação de altas concentrações de odor. Pode permanecer odor residual no tubo; lave o tubo de ar com etanol 95% e seque antes de continuar com amostras adicionais de tecido.
O software Axo graft fornece ferramentas para medir parâmetros-chave do sinal EOG. Esses parâmetros incluem a amplitude da resposta, a latência, o tempo para o pico e as constantes de tempo de término. Vários parâmetros do EOG são particularmente úteis para a comparação de respostas normalizadas entre camundongos, incluindo a amplitude da resposta, o tempo de subida da latência, o tempo para o pico e a constante de tempo de término.
Mostram-se aqui OGs de um camundongo em resposta à estimulação com concentrações crescentes de acetato de amila líquido. A linha preta na parte superior indica o momento e a duração da estimulação com o odorizante. Aqui observamos uma relação dose-resposta média obtida a partir de cinco camundongos; as barras de erro representam intervalos de confiança de 95%.
Uma diminuição na amplitude de pico é frequentemente observada em concentrações de odor muito altas. Um exemplo de EOG em resposta a uma estimulação com pulso emparelhado é mostrado; um único pulso curto de odorante provoca adaptação que dura vários segundos. Mostrado aqui está um EOG em resposta a 10 segundos de estimulação contínua com odorante.
O EOG mostra dessensibilização durante a apresentação contínua do odorante. Acabamos de mostrar como registrar o eletrodo fator grama de camundongos. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de posicionar o eletrodo apenas na superfície do epitélio e não penetrar com o eletrodo abaixo da superfície.
Registre sempre do mesmo lado da cabeça e evite modificações na montagem para minimizar variações; mantenha o tecido úmido, mas sem acúmulo de gotículas líquidas. Colocar o tecido sob ar umidificado imediatamente após a dissecação mantém o tecido no melhor estado possível para o registro. É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
Visão Geral
Este protocolo descreve a técnica de gravação do eletroolfatograma (EOG), um método confiável para avaliar a função olfativa ao nível do epitélio olfativo. O procedimento inclui o preparo do tecido, coleta de dados e análise básica dos dados.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Função Olfativa
- Eletrfisiologia
Antecedentes
- O EOG é uma ferramenta valiosa para o estudo dos neurônios sensoriais olfativos.
- Envolve a estimulação do epitélio olfativo com odorizantes.
- A técnica permite o monitoramento em tempo real das respostas elétricas.
- O entendimento da função olfativa é fundamental para diversas aplicações biológicas e médicas.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar um método para registrar EOG do epitélio olfativo de camundongo.
- Analisar as respostas dos neurônios sensoriais olfativos a diferentes odorantes.
- Fornecer um protocolo confiável para pesquisadores da área.
Métodos Utilizados
- Preparação do epitélio olfativo e configuração do eletrodo.
- Uso de um microscópio estereoscópico para posicionamento do eletrodo.
- Estimulação do epitélio com jatos de odorantes controlados por computador.
- Aquisição de dados por meio de um amplificador e um conversor analógico-digital.
Resultados Principais
- Gravação bem-sucedida de sinais de EOG a partir do epitélio olfativo.
- Demonstração da confiabilidade e facilidade de uso do procedimento.
- Análise das respostas neuronais a diversos odorizantes.
- Estabelecimento de um protocolo para pesquisas olfativas futuras.
Conclusões
- O método de registro de EOG é eficaz para estudar a função olfativa.
- Este protocolo pode ser utilizado por pesquisadores para explorar as respostas dos neurônios sensoriais olfativos.
- Estudos futuros podem se basear nesta técnica fundamental.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A gravação do eletroolfatograma na fase aérea (EOG) permite a avaliação quantitativa da função dos neurônios sensoriais olfativos (OSN) em modelos de camundongos geneticamente modificados, auxiliando na validação precoce de alvos e na redução de riscos mecanicistas na neurociência sensorial. Este método fornece leituras quantitativas e reprodutíveis das respostas dos OSN à estimulação por odoríferos, facilitando a comparação entre manipulações genéticas e farmacológicas. Sua confiabilidade e padronização tornam-no uma ferramenta valiosa para triagem de portfólios e pesquisas translacionais em biologia olfativa.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação direta de vias de transdução olfativa em camundongos geneticamente modificados.
- Permite a validação funcional de genes candidatos e componentes de sinalização em NSOs.
- Oferece desmistificação mecanicista mediante a quantificação da amplitude da resposta, latência e adaptação.
- Facilita a confiança preditiva na associação de alvos moleculares a fenótipos sensoriais.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Estabelece um ensaio padronizado e reprodutível para avaliar a função dos NOS em diferentes condições experimentais.
- Gera saídas quantitativas (amplitude, cinética) adequadas para análise comparativa.
- Permite a triagem de intervenções genéticas ou farmacológicas que afetam a sinalização olfativa.
- Permite a escalabilidade do ensaio e a reutilização da plataforma para painéis diversos de odorizantes.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com modelos relevantes para disfunção sensorial e desenvolvimento de biomarcadores translacionais.
- Proporciona continuidade desde a descoberta molecular até a validação pré-clínica de fenótipos olfativos.
- Informa decisões de avanço ajustadas ao risco para terapêuticas direcionadas aos sentidos.
- Oferece desvio preditivo para pesquisas translacionais em distúrbios olfativos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método de gravação de EOG se integra ao continuum de descoberta a pré-clínico, conectando manipulação genética, validação funcional e avaliação translacional de alvos olfativos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a testagem de hipóteses e a clarificação de vias de sinalização em neurônios sensoriais olfativos.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e reprodutíveis para o desenvolvimento de ensaios e avaliação de compostos.
- Análises: Oferece métricas de amplitude, latência e adaptação para comparações estatísticas robustas.
- Pesquisa Translacional: Permite alinhamento com modelos de doenças e estratégias de biomarcadores em neurociência sensorial.
- Reutilização Empresarial: Funciona como uma plataforma reutilizável para estudos genéticos e farmacológicos contínuos na olfação.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos de OSN.
- Valor Operacional: Padroniza a aquisição e análise de dados para reprodutibilidade e escalabilidade.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir/não prosseguir e a eficiência do capital em portfólios de alvos sensoriais.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco e o avanço de programas de pesquisa olfativa.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em eletrofisiologia e preparo de tecido murino.
- Necessita de instrumentação especializada, incluindo amplificadores, digitalizadores e sistemas controlados de entrega de odorizantes.
- Exige rigorosa padronização entre equipes quanto ao posicionamento dos eletrodos e aos protocolos de estimulação.
- A adaptação em diferentes backgrounds genéticos ou painéis de odorizantes pode exigir otimização do protocolo.
- A manutenção da viabilidade do tecido e a minimização da adaptação são fundamentais para a aquisição confiável de dados.
