Atividades de imagem Odor-Evocados no bulbo olfatório do rato usando reflectância óptica e Sinais de autofluorescência

O objetivo geral deste experimento é mapear as atividades evocadas por odores na superfície do bulbo olfatório de camundongos utilizando sinais ópticos intrínsecos e sinais de autofluorescência de flavoproteínas, ou imagem FAS, após anestesiar o camundongo e expor o crânio. O osso acima do bulbo olfatório é afinado. Uma aba óssea é criada com a ponta da lâmina de bisturi e, em seguida, removida; uma câmara é confeccionada com cimento dental e envolve a superfície exposta do bulbo olfatório.

É preenchido com aros e uma lamínula é colocada sobre esta preparação. Mapas olfativos são adquiridos sequencialmente no mesmo camundongo utilizando sinais ópticos intrínsecos e imagem FAS. A obtenção de outras atividades evocadas no bulbo olfativo de camundongos por meio de refletância óptica e sinais autofluorescentes pode ajudar a responder questões fundamentais sobre a organização espacial dos pedidos no bulbo olfativo. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a imagem com duas moléculas de glicose ou fMRI, é permitir o registro de atividades evocadas de ordens com uma resolução espacial de uma única glândula olfativa.

De modo geral, indivíduos novos nesses métodos terão dificuldades no início de seu trabalho, pois as habilidades cirúrgicas e instrumentais são adquiridas lentamente. A demonstração visual deste método é fundamental para chamar a atenção para os passos cruciais dos procedimentos cirúrgicos e de imagem. Aperte suavemente a pata traseira do camundongo para confirmar a anestesia e remova os pelos do couro cabeludo utilizando uma tesoura elétrica.

Limpe qualquer resíduo de pelos da pele com compressas estéreis embebidas em água destilada. Posicione o camundongo no estereotáxico de modo que o focinho fique no mesmo plano da parte posterior da cabeça. Para posicionar o bulbo olfatório na posição horizontal, fixe firmemente as barras auriculares e nasais para evitar movimentos.

Aplicar pomada oftálmica nos olhos para prevenir o ressecamento durante a aquisição de imagens e, em seguida, desinfetar a região do couro cabeludo com Betadine utilizando tesoura estéril. Fazer uma incisão na parte posterior da cabeça entre as orelhas, depois cortar em ambos os lados em direção à base da orelha e no sentido anterior-posterior em direção à testa ao longo das pálpebras. Finalizar a remoção do couro cabeludo cortando a pele do focinho.

Usando a barra nasal como guia, posicione o animal sob um microscópio estereoscópico e utilize um cotonete embebido em solução salina para desprender suavemente o periósteo na parte superior do crânio. Utilize um par de pinças para remover os tecidos remanescentes e raspe a superfície do crânio com uma lâmina de bisturi para garantir uma preparação limpa, mantendo assim a região do bulbo olfatório úmida durante todo o experimento.

Coloque um pedaço de esponja de gelatina absorvível, embebida em água destilada, sobre o osso acima do bulbo olfativo localizado entre os olhos. Remova a esponja de gelatina e comece raspando suavemente o osso com uma lâmina de bisturi número 10. Mantenha um ângulo constante de 45 graus entre a lâmina e o osso e mova a lâmina das pálpebras até o lado sagital da região do bulbo.

Tendo o cuidado de não aplicar pressão vertical sobre o osso nem arranhar o osso acima do seio venoso durante o processo de afinamento. Pare a cada cinco minutos e coloque uma esponja de gelatina hidratada sobre o osso para resfriar a preparação. Limpe o crânio com a esponja para remover fragmentos ósseos e poeira, e limpe periodicamente a ponta do bisturi para mantê-la limpa e afiada.

Continue até que a camada de osso esponjoso ou trabécula seja visível. Quando a fina vasculatura do bulbo olfatório for visível, pare de raspar o osso e use a ponta de um bisturi número 11 para delinear uma área retangular ao redor do bulbo olfatório. Mantendo a janela dentro dos limites dos seios venosos, continue raspando o osso dentro da área retangular.

Tenha extrema cautela com a profundidade da ponta do bisturi para evitar tocar a superfície da dura-máter. Para avaliar a espessura do osso remanescente, empurre-o suavemente com a ponta de uma pinça. Se o osso dobrar sob pressão, prossiga para a próxima etapa.

Adicione uma gota de solução salina e use a ponta do bisturi orientada horizontalmente para levantar a aba óssea. Remova cuidadosamente a aba com pinça, evitando arrancar o osso remanescente. Uma vez exposta a superfície do bulbo olfatório, verifique a ausência de sangramento ou vasos sanguíneos. Anastomose.

Limpe a área com uma esponja de gelatina embebida em solução salina. Para manter o bulbo olfativo úmido, aplique cimento dental de poliacrilato usando uma seringa de calibre 29 para formar um reservatório no osso ao redor da janela craniana. Coloque uma gota de parafina de baixo ponto de fusão sobre a dura-máter e posicione um cubre-objeto estéril sobre a janela craniana para a obtenção de imagens.

Posicione o estereotáxico sob o microscópio estéreo com a janela craniana centralizada no campo de visão focalizado para trazer os capilares à vista. Mude para luz verde de 580 nanômetros e capture uma imagem anatômica de controle para verificar o estado da preparação durante a aquisição de imagens. Em seguida, prossiga para capturar os ensaios de estimulação utilizando imagem de sinal óptico intrínseco sob iluminação de 630 nanômetros ou imagem de sinal autofluorescente de flavoproteína sob iluminação de 480 nanômetros. Uma sessão padrão de aquisição de imagens inclui uma linha de base de cinco a 10 segundos em que apenas ar é administrado, seguida pela estimulação com odor por três a 10 segundos, dependendo da concentração escolhida do odor.

E, finalmente, são registrados de 70 a 82 segundos de administração de ar para a recuperação da linha de base. Aqui, a vasculatura do bulbo olfatório é visualizada através da janela craniana, seguida pelos resultados de um ensaio de estimulação utilizando h sinal como odorizante, obtidos por meio das imagens iOS e FAS. Utilizando a imagem iOS, a atividade induzida pelo odor é mostrada como áreas escuras de absorvência; áreas ativadas pelo AL são indicadas pelas setas brancas, e áreas ativas podem ser observadas tanto em ensaios individuais quanto em média de múltiplos ensaios.

Alternando para a imagem FAS no mesmo olfato do camundongo, a atividade evocada agora é mostrada como áreas brancas de emissão de autofluorescência indicadas pelas setas pretas, e também pode ser observada em ensaios únicos e múltiplos médios. Observe que tanto as zonas pretas de absorção vistas com imagem iOS quanto as áreas brancas de emissão de autofluorescência vistas com imagem FAS se sobrepõem. Essa correspondência espacial confirma que as duas técnicas permitem a visualização dos mesmos glomérulos olfativos. Uma vez definida a ordem mestre de aquisição de imagens, atividades evocadas usando sinais de reflexão óptica e autofluorescência podem ser obtidas em uma hora para a cirurgia e algumas horas para a aquisição de imagens.

As principais desvantagens do uso desses métodos de imagem óptica são o fato de que eles não podem ser aplicados para visualizar mapas olfativos em camundongos livres para se movimentar. E devido à penetração limitada de fótons nos tecidos biológicos, eles não permitem o acesso aos glomérulos olfativos ventrais após seu desenvolvimento no final dos anos noventa, registrando sinais intrínsecos no sistema olfativo. Talvez uma maneira para pesquisadores na área de imagem óptica explorar as características do revestimento especial do odor.

Na imagem de autofluorescência de flavoproteínas no bulbo olfatório, uma técnica promissora fornece novos insights sobre o revestimento especial da OD usando sinais ópticos endógenos.