T-wave Ion Mobility Spectrometry massa: Basic Procedimentos para Análise Experimental Protein Complex

O objetivo geral do experimento a seguir é determinar a forma geral de complexos proteicos. Isso é alcançado mediante a obtenção de dados de mobilidade iônica em espectrometria de massas para íons de complexos proteicos e a medição dos valores de tempo de deriva de cada estado de carga. Como segundo passo, as condições experimentais são validadas para garantir medições de mobilidade de estruturas proteicas nativas.

Em seguida, os valores de tempo de deriva medidos são correlacionados com áreas de seção transversal. Os resultados determinam os valores de seção transversal de colisão de proteínas ou complexos proteicos com estruturas tridimensionais desconhecidas. Essas informações fornecem pistas sobre sua forma geral, empacotamento de subunidades e topologia.

Olá, sou Isaac Leski do Laboratório de Mic, do departamento de Química Biológica no Instituto de Ciências Wiseman, e sou Naam Kirschenbaum, também do laboratório de mi. Hoje demonstraremos um procedimento de medição da seção transversal de colisão de complexos proteicos utilizando espectrometria de massa híbrida e instrumentos de mobilidade iônica. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a forma geral e a organização espacial de complexos proteicos.

Então vamos começar. Este procedimento enfoca a mobilidade de ferro, análise por espectrometria de massas ou IMM MS de complexos proteicos. As etapas de preparação da amostra, calibração do instrumento e procedimentos de otimização da MS e MS em tandem são demonstradas em um protocolo JOVE relacionado.

Em geral, este protocolo envolve concentrações na faixa de micromolar baixa do complexo em um tampão volátil, como acetato de amônio. Como são consumidos um a dois microlitros por capilar de fluxo nano, prepare de 10 a 20 microlitros como volume mínimo para permitir a otimização das condições de espectrometria de massas. Para iniciar este procedimento, configure a onda de deslocamento ou T wave do IMMS Synap nas seguintes modalidades de operação: mobilidade TOF, na qual as ondas triplas e as pressões são ajustadas automaticamente tanto para a separação por mobilidade iônica quanto por tempo de voo dos íons, aquisição em modo de íons positivos e modo V, definindo o trajeto dos íons através do tubo de voo e reflexão, e ligue todos os gases aqui.

O nitrogênio é usado para separação por IM e o argônio para as regiões de aprisionamento e transferência. Os valores iniciais recomendados são um fluxo de gás de 24 mililitros por minuto para o dispositivo IMS e 1,5 mililitro por minuto para a região de aprisionamento. Em seguida, defina a faixa de aquisição da razão de carga do mastro para um complexo proteico desconhecido.

Utilize inicialmente uma faixa ampla de massa, que posteriormente pode ser reduzida aos valores desejados, ajustando o perfil de MS de acordo. Para obter a máxima eficiência de transmissão para complexos grandes, a faixa de aquisição de massa deve ser definida de 1030 a 2000 razão carga/massa e o perfil de MS em automático. Caso contrário, o perfil pode ser definido de acordo com o gráfico mostrado.

Verifique a configuração de RF e, se necessário, ajuste para valores apropriados para grandes complexos proteicos, conforme indicado. Em seguida, carregue a amostra, aplique a tensão capilar e pressão de fluxo nanométrico baixa. Uma vez iniciados os jatos, tente reduzir a pressão de fluxo nanométrico a um valor mínimo.

Além disso, ajuste a posição da capilar em relação ao cone e ajuste os parâmetros de aquisição do espectrômetro de massas para obter um espectro de MS bem resolvido. Otimize o gradiente de pressão ao longo do instrumento e do cone de amostragem, bem como os ajustes de potencial do cone de extração, do trap de polarização e do transfer, conforme detalhado no protocolo associado da JoVE. Embora esses parâmetros dependam da amostra, a seguir estão as condições utilizadas para a aquisição de espectros de MS de várias massas de ferro, desde peptídeos até complexos proteicos.

Íons grandes requerem energias de colisão e tensão de polarização mais altas. Também é recomendado aumentar a pressão de retorno para a análise de grandes complexos proteicos, a fim de minimizar a ativação do complexo. Tente reduzir gradualmente, em etapas de cerca de 10 volts, a extração do cone da amostra, as tensões do cone-trampa e de polarização, sem alterar a posição do pico.

Uma vez obtido um espectro de massa ideal, o tempo de deriva ou o perfil de mobilidade iônica (IM) devem ser ajustados ao analisar montagens proteicas. As condições ideais para medições de massa e mobilidade frequentemente são incompatíveis. Portanto, é importante encontrar o equilíbrio adequado entre as duas.

No geral, o gráfico de mobilidade iônica deve ser otimizado de modo que os picos estejam distribuídos por toda a faixa de tempo de deriva e o perfil do pico seja suave. Uma assimetria acentuada do pico pode estar relacionada à má separação de múltiplas conformações, à velocidade da onda T, à altura da onda T e à taxa de fluxo do gás IMS, que podem ser ajustadas para otimizar a separação por mobilidade. O aumento da velocidade da onda T amplia o perfil de distribuição do tempo de deriva.

Embora valores aumentados da altura da onda T a estreitem, aumentar igualmente o fluxo de gás IMS a partir de um mínimo de 10 mililitros por minuto desloca o perfil do tempo de deriva para valores mais altos, o que ajuda a otimizar o espectro de mobilidade do íon. Fixando duas das três variáveis e otimizando a terceira, ajuste a velocidade da onda T para 250 metros por segundo e o fluxo de gás para 24 mililitros por minuto. Em seguida, como ponto inicial, defina a altura em três volts e, de maneira progressiva, aumente-a em incrementos de um volt.

Quando são utilizadas tensões de polarização elevadas, recomenda-se reduzir a pressão do gás na IMS e, dessa forma, permitir a diminuição da tensão de polarização. Como consequência, ativações e dissociações complexas serão reduzidas. Um efeito de sobreposição pode ocorrer quando as condições não estão otimizadas, observado como um pico idêntico na parte inicial do espectro de tempos de deriva e na cauda final.

Quando os íons não atravessam o dispositivo IAM, efetivamente sua trajetória pode levar mais tempo do que o necessário para o próximo pacote de íons de ferro ser liberado na célula de mobilidade. Como resultado, um novo grupo de íons é liberado da região da armadilha antes que o pacote anterior tenha sido entregue à região do empurrador. Para eliminar esse artefato, aumente a altura da onda T e diminua a velocidade da onda T e a pressão da IMS.

Além disso, o tempo de liberação da armadilha pode ser ajustado. Além disso, é importante validar que a altura da onda de transferência T esteja definida em pelo menos cinco volts. Também para evitar vazamento de íons em direção à célula de IMS.

A altura do poço de mobilidade deve ser mantida em níveis máximos. Baixa velocidade e alta amplitude das ondas T de transferência podem levar ao surgimento de ondulações no perfil da distribuição do tempo de deriva. Esse artefato ocorre quando a separação por mobilidade dos íons não é mantida ao longo das regiões de transferência e de contato devido à sincronização parcial entre a frequência de empuxo e a velocidade da onda T de transferência.

Para eliminar esse efeito, deve-se ajustar o tempo do impulsionador ou a velocidade da onda T de transferência. Como a frequência do impulsionador está relacionada à faixa de massa, esse artefato pode reaparecer quando este parâmetro é alterado.

A altura da onda T exerce um efeito menor. Embora sua redução também possa ajudar a eliminar ondulações. Uma vez que os parâmetros mencionados sejam otimizados, os dados de IMMS podem ser adquiridos para obter alta resolução.

Complexos proteicos MS.Peaks são frequentemente ativados dentro do espectrômetro de massas para promover a remoção de água residual e componentes do tampão. No entanto, se a energia de ativação for aumentada além de um valor limite, pode ocorrer desdobramento parcial, formando múltiplos estados intermediários, que dificilmente correspondem à estrutura nativa no estado em solução. Como resultado, o pico de tempo de deriva pode ser deslocado e alargado, refletindo a população heterogênea de estruturas desdobradas.

Para obter dados de tempo de deriva consistentes com estruturas em fase aquosa, é essencial controlar cuidadosamente as tensões utilizadas para acelerar íons antes da separação por IM; portanto, aumente gradativamente as tensões do capilar e do cone, monitorando o efeito sobre o espectro de tempo de deriva. Além disso, para alta resolução em MS, é preferível aumentar a tensão de transferência em vez da tensão de aprisionamento. O dispositivo de IM é posicionado primeiro, seguido pela região de transferência e pelo analisador TOF.

Como a ativação segue a medição de IM, os dados permanecem inalterados para IM, enquanto a precisão de MS pode ser aumentada para garantir que a aquisição de dados seja realizada em condições que mantenham a estrutura nativa do complexo; é importante coletar dados ao longo de uma variedade de condições experimentais e em solução, em vez de aderir a um único conjunto otimizado de parâmetros. Por essa razão, aumente a tensão de colisão da armadilha de forma progressiva e adquira dados em intervalos de 10 volts, monitorando o efeito no perfil de mobilidade do íon. Por fim, para identificar as conformações desdobradas e avaliar os dados adquiridos, induza manualmente a dissociação do complexo proteico titulando a amostra com ácido acético em uma faixa de pH de dois a sete, registre os dados e prossiga com a análise dos dados no sistema T wave IMS, determinando as áreas transversais por meio de uma abordagem de calibração de tempo de deriva, utilizando proteínas Cain com valores de seção de choque conhecidos.

Primeiro, prepare soluções proteicas desnaturadas de calibração a 10 micromolar cada. Utilize citocromo C equino, mioglobina de coração e ubiquitina bovina em uma proporção volumétrica de água, metanol e ácido acético de 49, 49 e 0,2. Em seguida, obtenha os dados de IMMS para as proteínas de calibração nas exatas mesmas condições instrumentais utilizadas para a proteína-alvo ou complexo proteico, mantendo todos os valores de voltagem e pressão idênticos para preservar as configurações de separação por IM.

Após adquirir os dados, extraia o valor experimental do tempo de deriva para cada carga. Corrija cada um dos tempos de deriva calibrados T linha D das proteínas Cain utilizando a seguinte equação, em que MOVZ é a razão de carga principal do íon observado, e C é o coeficiente de atraso do ciclo de trabalho aprimorado EDC. Seu valor, tipicamente entre 1,4 e 1,6, depende do instrumento.

O valor de EDC é indicado dentro das configurações de aquisição do sistema, na guia de configuração de aquisição, corrigindo cada uma das seções eficazes para o estado de carga do ferro e para a massa reduzida. Onde omega C é a seção eficaz corrigida, omega é a seção eficaz da literatura, Z é o estado de carga do ferro, M é o peso molecular do íon cátion e MG é o peso molecular do ferro.

Gás de fundo, que normalmente é nitrogênio, plop o plano de T linha D contra o plano de ômega C. A curva resultante corresponde à seguinte equação. Os parâmetros X e A podem ser extraídos ajustando o gráfico a uma relação linear. A inclinação X corresponde ao fator de proporção exponencial, e A representa a constante determinada pelo ajuste.

Calcule o coeficiente de correlação do ajuste R quadrado. Valores aceitáveis para R quadrado são maiores que 0,95. Um valor mais baixo do coeficiente de correlação pode ser devido à desnaturalização incompleta da proteína ou ao envelhecimento da amostra.

Condições experimentais distintas utilizadas para proteínas de diferentes tamanhos, espectro ruidoso e processamento incompleto dos dados ou erro de cálculo. Corrija o tempo de deriva do cálcio utilizando o fator exponencial X determinado e valide seus cálculos refazendo o gráfico de ômega C versus T linha D. Defina novamente o coeficiente de correlação. Valores superiores a 0,95 devem ser esperados, de forma semelhante aos passos descritos anteriormente; corrija o tempo de deriva medido da proteína-alvo ou do complexo proteico e calibre o tempo de deriva da proteína-alvo ou do complexo proteico utilizando o fator exponencial X calculado. Calcule o ômega da proteína-alvo ou do complexo proteico utilizando a constante A determinada pelo ajuste, onde ômega é igual a A vezes T vezes D. Repita esses passos para cada condição experimental.

Ao definir a área da seção transversal da proteína ou do complexo proteico desconhecido, recomendamos que cada experimento seja repetido pelo menos três vezes e que o desvio padrão dessas medidas em triplicata seja determinado após a obtenção dos valores de seção transversal de colisão. Abordagens de modelagem são empregadas com o objetivo de prever a topologia ou os arranjos do complexo. Isso é feito ajustando os valores experimentais de seção transversal de colisão aos valores Omega calculados in silico a partir de estruturas modelo geradas. No geral, essa área ainda está em seus primeiros anos e é necessária uma maior evolução para tornar essa abordagem genérica e aplicável a uma ampla variedade de complexos.

Representação da superfície da forma tetramérica da hemoglobina bovina é mostrada aqui. O complexo transportador de oxigênio, hemoglobina, pode servir como exemplo para a abordagem mencionada acima. A hemoglobina é um complexo proteico tetramérico composto por duas subunidades alfa e duas beta, coloridas respectivamente em azul e vermelho, que formam um dímero de dímeros alfa-beta.

O espectro IMMS da hemoglobina é mostrado aqui. O espectro IM ms adquirido do complexo revela uma distribuição principal de séries de cargas correspondente ao complexo intacto e séries de cargas menores, que correspondem às massas do dímero alfa beta e das subunidades monoméricas alfa e beta. O CCS teórico e medido das diferentes formas da hemoglobina é mostrado aqui.

Os valores de tempo de deriva recuperados para diversos estados de carga das formas diméricas e tetraméricas foram utilizados para calcular os valores de ômega. Estes foram comparados aos valores teóricos. Considerando que um complexo tetramérico possui três possibilidades de associação, seja empacotamentos cíclicos, diédricos ou em cadeia.

Calculando o aumento na ômega ao passar de um dímero para um tetrâmero, pode-se prever a organização estrutural. Estudos anteriores e nossos próprios experimentos demonstraram forte correlação entre os ccss medidos e as áreas superficiais das proteínas derivadas de dados estruturais cristalinos. Essa correlação pode ser utilizada para calcular o aumento esperado na área superficial de um tetrâmero em comparação com um dímero para as diferentes formas de empacotamento.

Isso é feito considerando cada subunidade como um objeto asférico. Um arranjo em forma de cadeia aumentará a CCS do tetrâmero em cerca de duas vezes, enquanto um empacotamento C4 ou D2 resultará em um aumento de aproximadamente 1,5 e 1,67, respectivamente. A razão calculada entre os valores de CCS medidos das formas tetramérica e DME da hemoglobina foi de 1,57 ± 0,03.

Esse número ilustra que a estrutura nativa não é organizada linearmente, mas disposta em uma forma mais compacta, seja como um tetramero cíclico ou diedral. Ao repetir o mesmo cálculo na estrutura cristalina resolvida da hemoglobina, a razão entre as áreas superficiais das formas tetraméricas e DME foi de 1,63, o que corresponde a uma simetria D dois. Obviamente, esse modelo geométrico foi simplificado e as subunidades proteicas não são meramente esféricas.

No entanto, este cálculo demonstra o potencial promissor que a IMMS possui para revelar a estrutura de complexos cujas estruturas de alta resolução são desconhecidas. Acabei de mostrar como medir o tempo de deriva das proteínas e dos complexos proteicos, bem como calcular seus valores de seção transversal de colisão. Ao realizar este procedimento, é importante adquirir os dados de IMMS para as proteínas de calibração utilizando exatamente as mesmas condições usadas para a proteína alvo ou complexos proteicos.

Além disso, recomendamos fortemente repetir esses experimentos pelo menos três vezes e determinar o desvio padrão dessas medidas em triplicata. É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.