Padronizada fotoestimulação com dispositivos Digital Micromirror para Investigar Integração dendríticas em pontos Branch

O objetivo geral deste procedimento é controlar padrões complexos de luz no tempo e no espaço, de modo que possa ser utilizada para estimular neurônios. Isso é realizado primeiramente posicionando um chip DMD em um plano de imagem conjugado apropriado na trajetória óptica do microscópio. O segundo passo do procedimento é iluminar corretamente o DMD com uma fonte de luz intensa, como um laser.

O terceiro passo do procedimento consiste em eliminar o efeito de granulação da iluminação coerente. O passo final do procedimento é integrar uma interface gráfica do usuário para manipular o chip DMD. Em última análise, podem ser obtidos resultados que demonstram como experimentos anteriormente difíceis de realizar agora podem ser concluídos de forma relativamente simples por meio da lise em múltiplos sítios de neurotransmissores em gaiola utilizando o sistema DMD.

Olá, sou Michael Mohammed e do laboratório da Dra. Chaman Tang do Departamento de Neurologia da Universidade de Maryland. Hoje vamos mostrar um procedimento para gerar padrões complexos de eliminação em um microscópio óptico. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a integração dendrítica.

Então vamos começar. Este protocolo demonstrará o funcionamento de um dispositivo digital de microespelhos ou sistema de iluminação DMD para neurociência experimental. Um DMD é um chip semicondutor óptico com várias centenas de milhares de microespelhos móveis minúsculos dispostos em uma matriz retangular; na sua superfície, a posição de cada espelho corresponde ao pixel de uma imagem.

Cada espelho pode ser controlado individualmente para inclinar-se entre duas orientações. Na orientação desligada, a luz é direcionada para longe do eixo óptico da iluminação do espécime. Na orientação ligada, a luz é direcionada ao longo do eixo óptico.

O DMD é muito adequado para lise porque tolera luz UV intensa, gera altas razões de contraste entre os pixels ligados e desligados e pode alternar entre os dois estados em dezenas de microssegundos. A aplicação de DMDs na pesquisa biomédica é facilitada pelo amplo uso de software e hardware de manipulação de imagens, bem como pelo interesse comercial no campo da exibição de imagens. Componentes modulares são comercializados pela Texas Instruments como kits de descoberta DLP, que fornecem os drivers eletrônicos de suporte para adaptar o DMD a um sistema microscópico.

É necessário compreender os conceitos básicos sobre a óptica da microscopia. O microscópio fluorescente moderno básico é composto por um caminho de imagem e um caminho de iluminação. Ele é formado por uma objetiva, um cubo de filtros e duas lentes tubulares distintas para os caminhos de imagem e de iluminação.

O microscópio é projetado para possuir posições conjugadas ao plano da imagem do espécime, onde objetos em foco no plano do espécime também aparecerão em foco nesses planos conjugados de imagem. Uma consequência desse conceito é que qualquer imagem brilhante criada no plano conjugado de imagem também será projetada com nitidez sobre o plano da imagem do espécime. Essa estratégia é utilizada para projetar um padrão de iluminação gerado por computador sobre o espécime.

O feixe a laser atua como uma fonte de luz muito brilhante que iluminará o padrão implementado pelos microespelhos nos chips DMD posicionados em um plano de imagem conjugado. O projeto de um sistema de iluminação DMD depende das luzes de excitação utilizadas em experimentos de optogenética, que empregam luz em comprimentos de onda visíveis. O padrão iluminado pode ser conduzido através do caminho da câmera.

Portanto, o chip DMD pode simplesmente ser montado em uma das duas portas da câmera de um módulo com portas duplas para câmera. Inversamente, para experimentos que utilizam luz na faixa do UV, como a clivagem de compostos fotoativos, a luz deve ser conduzida através do caminho de iluminação epi e um plano de imagem conjugado mais acessível deve ser criado. Isso ocorre porque a lente tubular de imagem não é projetada para transmissão de luz UV.

Em vez disso, a lente do tubo de iluminação é utilizada para a transmissão de UV e desempenha um trabalho adequado na formação da imagem. Cada microespelho no DMD pode alternar entre uma inclinação positiva e negativa de 12 graus em relação ao plano do chip. Dependendo da entrada digital que recebe do computador, o eixo de rotação está ao longo das diagonais de cada espelho, a 45 graus em relação aos lados retangulares do chip.

A orientação da inclinação do espelho é indicada por um triângulo dourado em um dos cantos da superfície frontal do chip. A inclinação do microespelho determina o alinhamento do ângulo de elevação (pitch) e do azimute do feixe de iluminação incidente. Para iluminar o DMD, primeiro configure o ângulo de elevação do feixe de iluminação em 24 graus em relação ao eixo perpendicular do chip do DMD e ajuste o azimute para ser perpendicular ao eixo de rotação do espelho.

O alinhamento preciso do feixe é essencial para um funcionamento eficiente. Para experimentos de lise. Utilize uma fonte a laser para gerar o feixe de alta intensidade focalizável necessário para a liberação rápida.

Aqui, utiliza-se um laser de estado sólido trifurcado, com diodo quase contínuo e bombeado, ND ate, empregando um laser de potência relativamente alta, pois apenas uma pequena fração da saída do laser é efetivamente entregue ao espécime. Ao usar um sistema DMD, direcione a saída do laser para uma fibra multimodo, de modo que possa ser facilmente posicionada e orientada ao longo do eixo correto para iluminar o DMD, fornecendo uma solução para o problema de granulação gerado pela iluminação coerente, transmitindo a luz através da fibra óptica.

A fibra é enrolada ao redor de um esticador de fibra elétrico pazo que é acionado para oscilar em torno de 40 quilohertz. O alongamento microscópico da fibra é suficiente para mover o padrão de speckle várias vezes durante a duração de um milissegundo de cada pulso de estimulação fotônica, eliminando efetivamente o efeito speckle. Por fim, a saída da fibra óptica é colimada com um objetivo microscópico UV para iluminar os DMDs, e um software de imagem que correlaciona os pixels do CCD com os espelhos individuais dos DMDs foi desenvolvido.

A interface gráfica do usuário dentro do software permite que o usuário atribua a orientação do espelho DMD que corresponde à região na imagem CCD usando o mouse do computador por meio da interface gráfica do usuário. Marque a localização para a fotoestimulação movendo o cursor sobre a imagem exibida na tela do computador e clique na região de interesse marcada para programar os padrões de entrega de luz. O padrão marcado na tela do computador como uma série de imagens separadas programa o cronograma dos pulsos a laser para cada padrão espacial no software.

Isso irá integrar-se ao programa de aquisição de dados P clamp. Por fim, utilize o programa de aquisição de dados para coordenar o tempo dos circuitos eletrônicos do DMD, o controle de passagem do laser e a aquisição do sinal elétrico por grampo de membrana a partir do neurônio-alvo. Aqui, é apresentada uma calibração da resolução do sistema óptico.

O tamanho mínimo do ponto é mostrado conforme medido a partir de um alvo fluorescente. A resolução fisiológica efetiva é medida pela amplitude do fluxo de corrente em função da fotoestimulação. A posição do ponto aqui, o glutamato preso foi fotoativado adjacente a um ramo dendrítico de dois micrômetros de diâmetro.

À medida que o ponto foi movido ortogonalmente através da fenda, são ilustradas as respostas elétricas à fotoestimulação de diferentes intensidades. São apresentadas as respostas em clamp de voltagem em função da intensidade da luz.

A estimulação dendrítica distribuída pode ser facilmente implementada usando um sistema baseado em DMD. Aqui, a intensidade do estímulo foi variada aumentando o número de pontos de estimulação luminosa, marcados como círculos sobre os dois ramos dendríticos. A soma espacial pode ser não linear ao longo dos pontos de ramificação.

Torna-se cada vez mais superlinear com o aumento das amplitudes de entrada que chegam aos dois ramos da bifurcação. Esses resultados ilustram claramente a forma não linear de somação nos pontos de ramificação dendrítica. A superlinearidade é mediada principalmente por receptores NMDA e não por canais dependentes de voltagem.

Isso pode ser demonstrado pela aplicação de dois antagonistas do NMDA, PV e MK-801, que eliminam em grande parte o comportamento não linear. Acabamos de mostrar o projeto básico e o funcionamento de um sistema baseado em DMD para fotoestimulação com padrões de tecido neural. O sistema pode ser adaptado para estimulação com luz visível, como a utilizada em experimentos optogenéticos.

Ele também pode ser adaptado para luzes de UV próximo, como as utilizadas na lise por fóton único. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que, se uma luz com comprimento de onda inferior a 400 nanômetros for utilizada e a maioria das pessoas a direcionar pelo caminho da iluminação epifluorescente, o alinhamento preciso do feixe de iluminação dentro de alguns graus é essencial, e que, se uma luz coerente for utilizada, os efeitos de speckle devem ser efetivamente eliminados. É isso aí.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.