Comportamento de gravação em multicelulares Myxococcus xanthus Os biofilmes usando lapso de tempo Microcinematography

O objetivo geral do experimento a seguir é desenvolver um ensaio de microcinematografia com lapso de tempo barato e com rigor suficiente para gerar resultados reprodutíveis e quantificáveis. Isso é alcançado mediante o uso de juntas de silicone reutilizáveis e de baixo custo para a construção de placas com meio agros ou lâminas de microscopia. Os resultados obtidos demonstram que esses complexos de placas permanecem hidratados e suficientemente oxigenados por mais de uma semana, em diversos tipos de meio e concentrações de ágar.

Além disso, como a microcinematografia com lapso de tempo é um processo lento, o uso de oito microscópios baratos ajuda a acelerar a aquisição de dados. Olá, sou Ryan Taylor do laboratório do Dr. Roy Welch do Departamento de Biologia da Universidade de Syracuse. Hoje mostraremos um procedimento para produzir filmes com lapso de tempo de biofilmes bacterianos em nosso laboratório; utilizaremos este procedimento para estudar o comportamento multicelular de biofilmes MTIs.

Então vamos começar. Para iniciar este procedimento, meça a densidade celular de uma cultura de *Occus sanus* de crescimento noturno com um medidor de turbidez, transfira um mililitro da cultura para um tubo de centrífuga de 2,5 mililitros, centrifugue, lave e re-suspenda as bactérias em meio TPM conforme descrito no protocolo escrito anexo, pipete e vortexie para ressuspender completamente o pellet, o que pode levar algum tempo. Em seguida, adicione 0,5 gramas de aros a 50 mililitros de TPM, que é o meio de ensaio.

Adicione também 0,5 gramas de aros a 50 mililitros de C-T-T-Y-E, que é o meio nutritivo em disco, e autoclave para esterilizar. Em seguida, mantenha o meio a 55 graus Celsius em uma incubadora ou banho-maria. Enquanto constrói o ensaio de rastreamento.

Os complexos de placa prosseguem para construir o disco nutritivo primeiro esterilizador de chama microscópio de vidro. Deslize e coloque uma junta de borracha de silicone estéril com 0,5 milímetro de espessura sobre a lâmina. Pipete cerca de 300 microlitros de meio C TT YE aros no poço formado pela junta na lâmina.

O meio de cultura C-T-T-Y-E deve ser montado em chamas, esterilizar outro lâmina e colocá-la em um ângulo sobre os meios de cultura C-T-T-Y-E. Colocar a lâmina em um ângulo evita a formação de bolhas. Uma vez que a lâmina esteja no lugar, prenda o conjunto com clipes pequenos, um em cada lado.

Coloque o complexo recortado a quatro graus Celsius e deixe o ágar do meio C-T-T-Y-E solidificar. Isso geralmente leva cerca de cinco minutos. Uma vez que o ágar esteja solidificado, pode-se preparar os complexos de placa utilizados no ensaio de rastreamento.

Inicie preparando as lâminas para a construção dos complexos do ensaio. Para cada complexo, flame esterilize duas lâminas de vidro para microscopia. Coloque uma junta de autoclave sobre uma das lâminas para formar a base do ensaio.

O outro lâmina é usado para achatamento dos agros e como lâmina de suporte. O topo do ensaio é um lamínula. Primeiro, enrole uma lâmina de microscópio com fita adesiva de identificação, depois esterilize a lamínula de vidro com chama e coloque-a sobre a lâmina envolta previamente esterilizada.

Deslize para cima os suportes do porta-objetos para sustentar o lamínula, impedindo que ele quebre. Coloque uma junta de autoclave sobre o lamínula esterilizado por chama com uma pinça. Pressione as juntas na parte inferior do porta-objetos e no lamínula para garantir que formem um selo com o vidro.

Caso contrário, os meios dos arranjos podem secar. Reserve as juntas do lâmina e as juntas da lamínula com os lados esterilizados voltados para cima e, a partir daqui, trabalhe apenas em um complexo por vez para evitar que os meios de cultura solidifiquem, o que resultaria em baixa qualidade do filme. Comece colocando o disco nutritivo.

Retire o complexo de disco nutritivo de quatro graus Celsius. Remova o bind eclipse e separe previamente as lâminas, expondo os aros de C-T-T-Y-E agora solidificados, utilizando uma pipeta de microamostragem com ponteira descartável de vidro de 100 microlitros. Retire um disco nutritivo de um milímetro de diâmetro do ágar de meio C-T-T-Y-E também e coloque-o no poço criado pela junta na lamínula.

Em seguida, retire os ágares de meio TPM do incubador e pipete 300 microlitros para dentro do poço formado pela junta sobre a lamínula e contendo o disco nutritivo. O ágar de meio TPM deve formar um montículo para nivelar o ágar de meio T-P-M-S-A. Coloque uma das lâminas esterilizadas pela chama, sem junta, em um ângulo sobre o ágar de meio TPM. Posicionar a lâmina em um ângulo ajuda a prevenir a formação de bolhas.

Prenda o complexo com clipes de papel miniatura, um em cada lado. Coloque o complexo com clipe a quatro graus Celsius e deixe o meio endurecer. Isso geralmente leva cerca de cinco minutos.

Uma vez que o meio tenha solidificado, retire o complexo de quatro graus Celsius. Remova os clipes de papel e pressione a extremidade do complexo. Para soltar a lâmina envolvida na fita, remova a lâmina envolvida na fita e coloque-a sobre a bancada para uso posterior.

Em seguida, usando um par de pinças como cunha, separe o conjunto de lamínula, junta e meio de agarose do lâmina de suporte e descarte a lâmina de suporte. Não utilize um movimento de alavanca para separar o conjunto de lamínula e junta, pois isso poderia resultar na quebra da lamínula e/ou na aderência do arranjo de meio à lâmina de suporte.

Após remover a lâmina de suporte, coloque o conjunto de lamínula, junta e meio de cultura sobre a lâmina envolta em fita com o lado da junta voltado para cima. Coloque este conjunto ao lado de um bico de Bunsen para permitir que toda a umidade visível evapore da superfície recém-exposta do meio de cultura em ágar. Não deixe o meio de ágar secar por mais de um minuto.

Como isso pode afetar o comportamento coletivo de M Zant, prossiga para semear as células no complexo do ensaio recém-preparado. Assim que a umidade em excesso tiver evaporado do complexo de meio ágar na lamínula, aspire 0,5 microlitros das células concentradas para depositá-las no meio. Ao usar o pipetador, pressione o êmbolo antes de se aproximar do meio ágar.

Uma gota de células aparece na ponta da pipeta, facilitando a deposição das células sem que a ponta toque o ágar com meio de cultura. Uma depressão na superfície do ágar pode alterar o comportamento do enxame. Mova a pipeta diretamente para baixo para dispensar as células a aproximadamente um milímetro de distância do disco nutritivo embutido.

Em seguida, retire a pipeta diretamente para cima. Dessa forma, garante-se que o grupo seja circular. Após a deposição das células, coloque o complexo ao lado do bico de Bunsen para permitir que a gota de células seque por não mais de 20 segundos.

Após a secagem, alinhe o conjunto da junta do lâmina, formando a parte inferior do complexo, com a junta da tampa. Encaixe o meio da junta acrocelular formando a parte superior do complexo. Pressione suavemente para formar um selo.

Limpe as superfícies da lâmina e da lamínula com um lenço descartável para remover qualquer resíduo, a fim de evitar condensação. Coloque o conjunto na platina aquecida do microscópio imediatamente após limpar as lâminas, com a lâmina para baixo e a lamínula para cima. Se tiver se formado condensação, deixe o conjunto da lâmina sobre a platina aquecida por alguns segundos antes de iniciar o software de aquisição de imagens.

Para preparar o filme, escolha a objetiva apropriada, de 2 x 4 x ou 10 x no microscópio. Ligue a câmera e o microscópio e verifique os níveis de luz para garantir que ela não esteja muito intensa. Ligue o computador e abra o programa de aquisição de imagens.

Clique na janela da imagem em tempo real e foque o microscópio. A imagem aparecerá semelhante à mostrada aqui. Inicie a aquisição de imagens.

Certifique-se de verificar o foco regularmente durante a primeira hora, pois o ágar do meio tende a sedimentar, causando desvio do foco. Após a conclusão da aquisição de imagens, transfira as imagens adquiridas para armazenamento. Desmonte o conjunto do lâmina mergulhando em etanol 90% durante a noite ou desmonte as vedações para reutilização.

Este filme com lapso de tempo mostra em submetidos ao ensaio de rastreamento descrito aqui. A taxa de captura é de uma imagem por minuto com uma ampliação de 20x; a taxa de reprodução é de 60 imagens por segundo. Este filme com lapso de tempo mostra uma população de eant as células em que 1% das células estão expressando GFP.

O vídeo foi compilado mesclando imagens alternadas de contraste de fase e fluorescentes. O ensaio foi realizado em C-T-T-Y-E com taxa de captura de 1% Aros, com uma imagem por minuto, com uma ampliação de 100 x. Este filme em lapso de tempo mostra a motilidade deslizante de M Anthes.

Este ensaio foi realizado em C-T-T-Y-E com taxa de captura em 1% Aros de uma imagem por minuto com uma ampliação de 100 x. Este filme em lapso de tempo mostra a motilidade por contorção de P OSA. Este ensaio foi realizado em LB com taxa de captura em 1% Aros de uma imagem por minuto.

Com uma ampliação de 20x, a taxa de reprodução é de 60 imagens por segundo. Este filme em lapso de tempo mostra a motilidade coletiva de Smar. Este ensaio foi realizado em LB e 1% de Aris, com uma taxa de captura de uma imagem por minuto.

Com uma ampliação de 20x, a taxa de reprodução é de 60 imagens por segundo. Este filme com lapso de tempo mostra a motilidade deslizante de EGT. Este ensaio foi realizado em LB com 0,5% de Tag; a taxa de captura é de uma imagem por minuto, enquanto a ampliação de 20x resulta em uma taxa de reprodução de 120 imagens por segundo devido à fragilidade do meio com 0,5% de arose em lv.

Este ensaio emprega o uso das juntas maiores observadas na figura um B. Acabamos de mostrar como gerar filmes com lapso de tempo de biofilmes bacterianos. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de ter calma e ser o mais preciso possível para obter resultados consistentes.

É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.