Imagem crônica de rato Visual Cortex usando uma preparação diluída crânio-

As espinhas dendríticas são protrusões da membrana do dendrito de um neurônio que recebem entrada sináptica. O alongamento, encolhimento, aparência ou desaparecimento das espinhas ocorre em resposta a mudanças na função da rede neural resultantes de padrões específicos de atividade neural. Esse fenômeno é conhecido como plasticidade cortical para observar alterações morfológicas nas espinhas dendríticas.

Em animais vivos, uma placa de imagem é fixada ao crânio de um camundongo. Uma área do crânio é cirurgicamente afinada e são obtidas imagens em baixa e alta ampliação. As áreas são então reimagem em pontos temporais posteriores.

Os resultados obtidos mostram que a morfologia dos espinhos dendríticos pode ser claramente visualizada usando uma preparação de crânio fino em múltiplos pontos temporais. E que a morfologia dos espinhos é altamente plástica, apresentando mudanças na estrutura, bem como o aparecimento e desaparecimento de espinhos dendríticos. Olá, sou Emily Kelly no laboratório de Anaya Maka, do Departamento de Neurobiologia e Anatomia da Universidade de Rochester.

Hoje vamos mostrar o procedimento para a imagem crônica do córtex vial de camundongo após uma preparação chamada fins. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar a renovação das espinhas dendríticas. Então, vamos começar.

Inicie o procedimento esterilizando os instrumentos para cirurgia asséptica. Em seguida, esterilize o espaço de trabalho usando etanol 70% e cubra a superfície operatória com curativo limpo. Monitore a profundidade da anestesia em um camundongo anestesiado com coquetel de fentanil testando sua resposta a um aperto no dedo do pé; o camundongo mostrado aqui é um camundongo transgênico A-G-F-P-M no qual a GFP é expressa.

Nas células parametais da camada cinco que projetam processos dendríticos para as camadas superficiais. Para manter uma temperatura corporal de 37,5 graus Celsius, coloque o animal sobre uma manta aquecida e monitore-o com um termômetro retal acoplado. Em seguida, aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar que sequem, utilizando uma tesoura.

Remova os pelos da parte de trás da cabeça do camundongo, da região atrás das orelhas até os olhos. Em seguida, limpe a parte superior da cabeça do animal com uma aplicação de etanol 70%, seguida de esfregaço com Betadine e solução de Betadine. Faça uma incisão em forma de LCU atrás das orelhas e ao longo do lado direito ou esquerdo da linha média, dependendo do hemisfério que será analisado até os olhos, e dobre a pele para longe do local cirúrgico.

Não remova a pele, pois ela será suturada posteriormente usando pinças finas. Puxe suavemente a pele para cima e para longe da área de interesse. Usando pinças limpas, raspe suavemente o pericrânio da área exposta do crânio.

Aplique uma pequena quantidade de cloreto férrico a 10% sobre o crânio para secar completamente a membrana do periósteo e garantir sua remoção total. É importante que o crânio esteja completamente seco. Para assegurar uma boa aderência da cola, remova suavemente o periósteo seco com uma lâmina microcirúrgica.

Em seguida, aplique uma fina camada de cola acrílica Sano ao redor da janela de imagem da placa craniana de aço inoxidável e fixe a placa ao crânio. Com a extremidade de madeira de um cotonete, aplique cola nas juntas internas da janela de imagem, certificando-se de preencher todas as lacunas entre a placa de imagem e a curvatura do crânio. Coloque uma gota do acelerador de cola dentro da janela.

Em seguida, remova rapidamente o excesso. Deixe a cola secar completamente. Usando uma broca dentária acoplada a uma fresa de aço inoxidável de 0,7 milímetro, comece a afinar o crânio na janela de imagem.

Realize perfurações alternadas com aplicações ocasionais de solução salina estéril a 0,9%. Para evitar gerar excesso de calor no crânio. Afinar uma janela de quatro por quatro milímetros no crânio utilizando pequenos movimentos sobre a superfície óssea.

Com a broca dentária. Teste a finura do crânio com pinça de ponta romba. A superfície do crânio apresentará uma leve depressão com pressão suave.

A espessura óssea ideal para imagem varia entre 10 e 30 micrômetros. Após afinar o crânio, limpe a janela de todos os detritos e coloque solução salina sobre o crânio. Fotografe a janela de imagem com uma câmera digital acoplada a um microscópio estereoscópico.

A vascularização cerebral nesta fotografia ajudará a localizar a posição para colocar a placa de imagem em sessões subsequentes. Transporte o animal para o equipamento de microscopia de dois fótons. O animal deve permanecer sobre a manta aquecida e a temperatura corporal deve ser monitorada continuamente durante toda a sessão de imagem.

Um microscópio de dois fótons com um laser mi tai. Utiliza-se uma bomba estado-sólido de 10 watts para potência máxima e uma unidade confocal Olympus Flow View modificada. O sistema é otimizado para imageamento de tecidos profundos e detectores externos são instalados o mais próximo possível do objetivo para permitir a detecção máxima da fluorescência proveniente do cérebro; adicione uma gota de solução salina à janela de imageamento usando zoom digital baixo.

Identifique uma área contendo neurônios fortemente marcados utilizando uma câmera digital acoplada ao microscópio. Ips, tire uma fotografia da área de imagem. Isso é necessário para retornar ao mesmo local de imagem em um ponto temporal subsequente.

Obtenha uma pilha de baixa ampliação em toda a extensão visível do cérebro, mostrando o grau de ramificação dendrítica. Isso será usado para localizar a área de imagem em pontos temporais subsequentes, tanto em vasos sanguíneos quanto em dendritos. Mantenha sua estrutura em animais jovens e adultos utilizando software de imagem.

Aumente a ampliação digital oito vezes, ajuste as coordenadas XY se necessário e colete uma pilha de alta ampliação, que mostrará a morfologia dendrítica detalhada, incluindo as localizações e estrutura das espinhas dendríticas. Faça anotações detalhadas sobre cada coleta de pilha, incluindo as coordenadas do panorâmico, a faixa de coleta, o tamanho do passo Z e o número de passos na pilha. Essas anotações serão usadas ao retornar a este dendrito ou axônio em um momento posterior.

Após a aquisição de imagens, remova a placa craniana separando-a suavemente da superfície do crânio. Usando pinça, remova qualquer resíduo de cola e limpe o crânio com solução salina estéril a 0,9%.

Suture a pele sobre o crânio utilizando fio de sutura número seis. Limpe a área com etanol 70% após o procedimento de imagem. Coloque o animal em uma gaiola limpa sob uma lâmpada de aquecimento até que desperte e esteja móvel.

Em seguida, devolva o animal à sua gaiola original para imagiar o animal novamente em um ponto temporal posterior, entre dois dias e vários meses depois, remova os pontos e reabra a pele na cabeça. Usando métodos assépticos, utilize a imagem digital da vasculatura cerebral obtida durante a primeira cirurgia para localizar o local original de imagiologia. Em seguida, fixe novamente a placa craniana como anteriormente.

Use uma lâmina microcirúrgica para remover suavemente qualquer osso que possa ter regenerado entre os pontos temporais de imagem, se necessário. Afine com uma broca dentária, limpe a janela de imagem de detritos e aplique uma gota de solução salina estéril a 0,9%. Transporte o animal para um microscópio de dois fótons e localize a área original de imagem usando a imagem fluorescente digital obtida durante a sessão anterior.

Inicie o programa de visualização de fluxo. Abra a imagem original de baixa ampliação, fixe uma folha de transparência na tela do computador e esboce o padrão principal dos vasos sanguíneos usando uma caneta para transparência. Em seguida, abra a imagem em tempo real e realinhe a vasculatura sanguínea ao padrão esboçado na película de transparência.

Remova a transparência para reimaginar as estruturas ampliadas oito vezes. Abra a pilha desejada coletada na sessão de imagem anterior. Desenhe a estrutura sobre um filme de transparência fixado na tela do computador.

Aumente o zoom oito vezes a partir da imagem em tempo real e alinhe a imagem com a transparência. Dependendo da precisão do alinhamento na baixa magnificação, pode ser necessário ajustar ligeiramente o ângulo da imagem, definindo as coordenadas de panorâmica para os parâmetros de imagem do primeiro dia, incluindo o tamanho do passo e o número de imagens coletadas. A reimagem Zack pode ser realizada duas vezes. O número de vezes que o couro cabeludo é aberto deve ser limitado para evitar comprometer a integridade do crânio, o que resultaria em baixa resolução de imagem em camundongos que expressam GFP.

Um subconjunto de células parametais da camada cinco e os respectivos processos dendríticos foi visualizado utilizando microscopia de varredura a laser de dois fótons in vivo aqui; dendritos do córtex visual marcados com GFP são mostrados. Esta imagem é uma projeção de uma única imagem obtida a cada cinco micrômetros da PIA até uma profundidade final de 175 micrômetros. A região destacada em caixa é mostrada em maior ampliação aqui no dia zero e novamente no dia quatro; aqui, ampliações maiores de imagens de um ramo dendrítico dos dias zero e quatro são comparadas.

Essas imagens demonstram espinhos estáveis indicados pelas cabeças de seta brancas, espinhos retráteis perdidos, marcados pela cabeça de seta vermelha, e novos espinhos indicados pela cabeça de seta verde. Acabamos de mostrar como realizar a imagem crônica por dois fótons no córtex visual de camundongos utilizando uma preparação de crânio fino. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de ter cuidado especial durante o processo de adelgaçamento para evitar danos ao crânio e à dura-máter subjacente, pois isso resultará em baixa resolução de imagem, além de tomar notas detalhadas.

É isso aí. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.