Um procedimento de cirurgia Craniotomia para Brain Imaging crônica

As técnicas de imagem estão se tornando cada vez mais importantes no estudo da função cerebral. Entre elas, a microscopia a laser de dois fótons surgiu como um método extremamente útil, pois permite o estudo do cérebro de formigas vivas e, com preparações apropriadas, a observação da mesma área cortical cronicamente, de minutos a meses.

Neste vídeo, mostramos um procedimento para imagem crônica in vivo do cérebro utilizando microscopia fotônica dupla. O Dr. Carl Voda, pesquisador do Howard Hughes Medical Institute no Janelia Farm, inicialmente desenvolveu o preparo de janela craniana que demonstraremos hoje. Olá, sou Ricardo Must, do laboratório de Carlos Portera-Caio, do Departamento de Neurologia da Universidade da Califórnia em Los Angeles.

Hoje vamos mostrar o procedimento para criar uma janela craniana para imagem crônica in vivo. Esse preparo é muito útil porque permite imagens profundas no interior do cérebro utilizando microscopia a laser de dois fótons. Então, vamos começar.

Antes de iniciar a cirurgia, os camundongos são anestesiados com isoflurano: 4% para indução, 1,5 a 2% para a cirurgia, utilizando procedimentos aprovados pelo IACUC. É importante utilizar pinças na cauda e/ou nos dedos das patas para garantir que o animal esteja completamente sedado. Usando uma máquina de tosar roedores, o pelo da parte de trás do pescoço até os olhos é aparado.

Após a depilação, o camundongo é colocado em um estereotáxico, apoiado sobre uma manta com circulação de água ajustada a 37 graus Celsius, e a cabeça é firmemente fixada utilizando hastes auriculares. Em seguida, é aplicado um unguento nos olhos para evitar que os olhos do animal sequem. Depois, são administrados dexametasona, 0,2 miligramas por quilograma, e carprofeno, cinco miligramas por quilograma, por via subcutânea.

Para prevenir respectivamente o inchaço cerebral e uma resposta inflamatória. Antes de iniciar a cirurgia, certifique-se de esterilizar a área operatória limpando a pele com três aplicações alternadas de álcool 70% e Betadine. Todos os instrumentos cirúrgicos foram previamente esterilizados utilizando um esterilizador de contas de vidro, com tesouras que foram pulverizadas com etanol.

A pele na parte superior do crânio é removida, começando com um corte horizontal ao longo da base da cabeça, seguido por dois cortes na direção rostral, quase alcançando as pálpebras. Em seguida, dois cortes oblíquos que convergem na linha média. Nesse momento, uma gota de solução de lidocaína e epinefrina é aplicada sobre o periósteo para evitar sangramento excessivo ou dor; com um bisturi, o periósteo é retratado até as bordas do crânio.

A musculatura da parte posterior do pescoço também é levemente retratada. Em seguida, toda a área exposta do crânio é suavemente raspada com um bisturi para criar uma superfície seca. Isso é muito importante porque permitirá que a cola adira melhor quando for aplicada posteriormente.

Uma vez escolhido o local de imagem, está-se pronto para criar primeiro a janela craniana. Um círculo de aproximadamente quatro milímetros de diâmetro é desenhado suavemente com uma broca dentária pneumática. Após uma leve perfuração, a solução de lidocaína com epinefrina é aplicada novamente sobre a superfície do crânio.

A perfuração é interrompida quando resta uma camada muito fina de osso, normalmente de uma espessura equivalente a um nariz. Esta fase é alcançada ao pressionar suavemente o centro da craniotomia para sentir como cede sob uma gota de solução salina, aproveitando a estrutura trabecular do osso. Uma estrutura óssea esponjosa.

A craniotomia é removida do crânio com pinças de ponta muito fina. O soro fisiológico é importante porque ajudará a levantar o crânio e prevenir o sangramento da dura-máter. Em seguida, espuma de gel previamente embebida em soro fisiológico é aplicada sobre a meninge para estancar qualquer pequeno sangramento que por vezes ocorre ao remover o crânio.

Após secar a superfície da dura-máter e garantir que não haja sangramento, uma lâmina de vidro estéril de cinco milímetros é colocada suavemente sobre a dura-máter. Uma gota de cola à base de cianoacrilato é aplicada no hemisfério oposto do crânio. Com a ajuda de uma agulha, a cola é aplicada cuidadosamente ao redor de toda a janela, tomando o cuidado de não colocá-la sob o vidro.

Agora pode-se aplicar uma camada fina de cola sobre toda a superfície do crânio. Após a secagem da cola, prepara-se o acrílico dental e aplica-se sobre toda a superfície do crânio, cobrindo também uma pequena borda da lamínula para fixá-la. Após fixar a lamínula, forma-se um pequeno reservatório ao redor da janela com acrílico dental.

Uma barra de titânio também é embutida no acrílico dental. Essa barra será usada posteriormente para fixar o camundongo firmemente na platina do microscópio. Para a obtenção de imagens, é importante garantir que a barra esteja nivelada, de modo que fique paralela à janela craniana.

Colocar um pedaço de papel sob a barra pode permitir que ela permaneça nivelada enquanto o acrílico endurece; o acrílico dental é deixado curar ou endurecer por 10 minutos, momento em que a barra de titânio já está fixada no lugar. Em seguida, o animal é colocado em uma gaiola aquecida até que se recupere. Após a recuperação da anestesia, o animal pode ser submetido a imagens no mesmo dia.

Este vídeo mostra uma pilha de 160 imagens obtidas em intervalos de cinco mícrons com nosso microscópio de dois fótons personalizado através de uma janela craniana posicionada sobre o córtex somatossensorial de um camundongo GFPM de três meses de idade. Esta linhagem transgênica de camundongos expressa GFP em um pequeno subconjunto de neurônios parietais. Nas camadas cinco e dois-três, a imagem foi obtida com uma objetiva de imersão em água de 40x com abertura numérica de 0,8, utilizando um comprimento de onda de excitação de 910 nanômetros.

Nas imagens mais superficiais, é fácil reconhecer os arbórios dendríticos dos dendritos apicais das células parametais. O tufo apical dos dendritos de cada neurônio converge em um único dendrito apical grande. Pequenos dendritos oblíquos também podem ser vistos saindo desse dendrito apical principal; axônios cruzando o campo de visão também são evidentes.

Esta é uma pilha de 12 imagens obtidas a cada um e meio mícron, utilizando o mesmo objetivo de 40x com maior aumento, mostrando um dendrito superficial em alta resolução, suficiente para distinguir espinhos dendríticos individuais. Acabamos de mostrar como realizar uma preparação de janela craniana para imagens crônicas do cérebro por microscopia fotônica. Este é um método extremamente poderoso para o estudo do cérebro, pois permite investigar tanto a estrutura quanto a função do cérebro vivo, não apenas em uma única imagem, mas também de forma crônica, por meio de múltiplas imagens ao longo de períodos de meses.

Outra vantagem do preparo da janela craniana é que uma grande área de visão pode ser imageada, o que permite visualizar estruturas grandes, como um neurônio inteiro ou a árvore dendrítica, ao longo de milímetros. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de trabalhar nas condições mais limpas e estéreis possíveis e ter uma mão muito firme. Ok, e é isso.

Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.