Resposta celular ao vivo para Estimulação mecânicas estudadas por Microscopia de Força Atômica e Óptica Integrada
4 de outubro de 2010
Este trabalho tem como objetivo instruir o leitor na operação de um sistema integrado de força atômica-microscópio óptico de imagem para a estimulação mecânica de células vivas em cultura. Um protocolo passo a passo é apresentado. Um representante conjunto de dados que mostra a resposta de células vivas ao estímulo mecânico é apresentado.
O estudo da resposta celular em tempo real à estimulação mecânica é realizado primeiramente cultivando células que expressam proteínas de fusão GFP em placas com fundo de vidro por 24 horas. O segundo passo é revestir a ponta do microscópio de força atômica (AFM) com fibronectina biotinilada. Em seguida, a ponta funcionalizada do AFM é colocada em contato com a superfície celular para permitir a formação de uma adesão focal forte ao redor da ponta do AFM, possibilitando a manipulação direta do citoesqueleto de actina por meio de uma ligação entre a ponta revestida de fibronectina e a célula, envolvendo integrinas matriciais e actina.
O passo final consiste em estimular mecanicamente a célula viva por meio de um movimento ascendente controlado da ponta do microscópio de força atômica (AFM), de modo que a força vertical seja aplicada no ponto de contato com a célula sem romper a adesão focal forte. Em última análise, os resultados mostram que as células respondem à estimulação mecânica reforçando sua adesão ao substrato e induzindo a reorganização do citoesqueleto de actina, conforme registrado por meio de imagem óptica fluorescente em tempo real. Olá, sou Andrea Trake, professora assistente do Departamento de Biologia de Sistemas e Medicina Translacional do Texas A&M Health Science Center.
Olá, eu sou Sum Lim. Sou pesquisador pós-doutorando no Departamento de Biologia de Sistemas e Medicina Translacional do Texas A&M Health Science Center. Hoje vamos mostrar um procedimento para estudar a remodelação celular adaptativa frente à estimulação mecânica.
Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para investigar em tempo real a remodelação do citoesqueleto em células musculares lisas vasculares vivas. Então, vamos começar. Para esses estudos, utiliza-se um microscópio invertido Olympus IX 81 com um sistema de fluorescência por reflexão total interna ou acoplamento TIRF combinado a uma cabeça de varredura CSU 22 da Yokogawa.
Um microscópio de força atômica bio scope SZ está montado sobre o microscópio óptico invertido. Todo o sistema está montado sobre uma mesa óptica de pesquisa e já foi descrito em detalhes anteriormente. Este microscópio integrado utiliza duas câmeras eletrônicas multiplicadoras de carga acopladas por junção, ou E-M-C-C-D.
Um é para imagem de campo e o outro para imagem confocal. O conjunto confocal, composto pelo escaneador de disco giratório, roda de filtros externa e uma câmera E-M-C-C-D, é montado em uma placa de base de alumínio colocada sobre uma almofada de silício, necessária para amortecimento de vibrações. Todo o conjunto confocal se conecta ao microscópio por meio de uma flange com colar rosqueado.
Assim, a montagem pode ser desacoplada do microscópio durante a microscopia de força atômica ou medições de FM para evitar vibrações provenientes do scanner de disco giratório. Um laser de argônio criptônio é usado como fonte de excitação para os modos de imagemamento TIRF e confocal. O laser pode ser acoplado a uma das duas fibras ópticas, que conduzem o laser ao acessório TIRF ou à cabeça de varredura confocal.
Dois computadores controlam o sistema. Um utiliza um software de slide book, que controla a imagem óptica, e o outro utiliza um software de nanoscópio, que controla o AFM. Vinte e quatro horas antes do experimento de estimulação mecânica, coloque células vivas expressando construtos GFP direcionados contra proteínas específicas em uma placa de cultura celular com fundo de vidro. No dia do experimento, substitua o meio de cultura celular por um meio livre de vermelho de fenol.
Como o experimento de MF é muito sensível a ruídos, evite falar ou tocar a mesa óptica ou o microscópio durante o experimento para minimizar o ruído. Nas medições de MF, desacople o disco giratório confocal do microscópio. O experimento começa montando a placa de cultura celular na platina de MF com um colar magnético para fixar a placa à platina magnética do microscópio.
O cantiléver em forma de V no sensor de MF-A é personalizado com a microesfera de vidro biotinilada de dois mícrons. O cantiléver pode ser facilmente visualizado usando o microscópio. A esfera é colada na extremidade do cantiléver, e é nesse ponto que a solução de revestimento deve ser aplicada gota a gota.
Para preparar uma sonda FM para o experimento, primeiro fixe a ponta no suporte de vidro e, em seguida, coloque o suporte de vidro no suporte da mesa para revestir a ponta. Lave a ponta gotejando cuidadosamente 10 microlitros de docos fosfato tamponado com salina ou DPBS na extremidade da ponta e, depois, use uma toalha de papel limpa para secar a ponta. Repita este procedimento cinco vezes após a lavagem com DPBS a um miligrama por mililitro.
Avide em solução. Gota a gota sobre a ponta. Deixe a ponta incubar por cinco minutos após o revestimento com avadon.
Lave a ponta mais cinco vezes com DPBS. Em seguida, realize a reticulação da fibronectina biotinilada sobre o avadon adicionando uma solução de um miligrama por mililitro, gota a gota sobre a ponta e incubando por cinco minutos.
Por fim, lave novamente a ponta cinco vezes com DPBS, deixando a última gota na ponta. Uma vez que a ponta tenha sido preparada, acople-a ao scanner de FM. Após acoplar a ponta de FM, coloque uma saia protetora de silicone ao redor do suporte.
Em seguida, configure o microscópio para visualização em vídeo. Depois, alinhe uma ponta de FM no centro do campo de visão. Ajuste a alavanca óptica posicionando o feixe de laser na extremidade do cantiléver.
Em seguida, mude a objetiva para a objetiva de alta magnificação apropriada para a imagem individual de células. Então, traga a célula, que será mecanicamente estimulada, para o campo de visão e escolha um local onde a ponta de FM deve tocar a superfície celular. Por fim, abaixe a ponta de FM até que ela entre em contato com essa célula específica.
Após colocar a ponta em contato com a célula, aguarde aproximadamente 20 minutos. Isso permite que uma adesão focal forte se forme no ponto de contato do MF na superfície celular. Após o período de espera, o procedimento de estimulação mecânica pode ser iniciado para preparar o experimento de estimulação mecânica.
Altere da câmera de vídeo para a câmera E-M-C-C-D para permitir a visualização das células fluorescentes durante a aquisição de imagens. Em seguida, adquira uma imagem inicial da célula em repouso. Utilize microscopia de disco giratório e microscopia vocal para a visualização do citoesqueleto ao longo do corpo celular.
Por outro lado, utilize o turf para visualizar adesões focais a fim de estimular a célula. Use o cantilever para aplicar um movimento controlado para cima em etapas discretas a cada três a cinco minutos. Durante a aquisição dos dados de MF-A, é importante que o operador monitore constantemente a voltagem da posição Z do piso para determinar o momento adequado para o polo vertical.
Simultaneamente à aquisição de dados de FM, registre uma imagem confocal ou de campo claro da célula após cada tração vertical, utilizando o software Slide Book. Por fim, retire a ponta de FM da célula ao finalizar o experimento de estimulação. Uma célula muscular lisa vascular transfectada com actina MRFP e vcul.
A GFP foi visualizada usando um MF na superfície apical da célula. A mesma célula foi visualizada usando turf na superfície basal da célula. Aqui, as duas imagens são sobrepostas.
Uma imagem da mesma célula também foi obtida usando microscopia confocal de disco giratório em todo o corpo celular e é apresentada como uma projeção máxima de uma pilha 3D. São mostradas boas sobreposições entre as imagens de MF-A e de microscopia confocal de disco giratório. Essa célula muscular lisa vascular transfectada com actina MRFP foi mecanicamente estimulada pela MF-A e imagemada por microscopia confocal de disco giratório.
Os erros indicam fibras de actina que exibem uma reestruturação notável após uma estimulação por FM. Algumas fibras de actina se polimerizam, enquanto outras se despolimerizam devido à estimulação mecânica; outras fibras de actina se agrupam em feixes. Devido à reestruturação da actina, acabamos de mostrar como estimular mecanicamente uma cultura viva utilizando EFM, ao mesmo tempo em que se registra o rearranjo do citoesqueleto por meio de métodos de imagem óptica.
Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que um experimento de MF é extremamente ruidoso e sensível. É isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para o uso de um microscópio integrado de força atômica e imagem óptica com o objetivo de estimular mecanicamente células vivas em cultura. A metodologia inclui um guia passo a passo e demonstra dados representativos das respostas de células vivas à estimulação mecânica.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia celular
- Estímulo mecânico
- Imagem de células vivas
Antecedentes
- Compreender a resposta celular a estímulos mecânicos é fundamental na biologia celular.
- A microscopia de força atômica permite a manipulação precisa de células.
- A imagem de células vivas fornece insights em tempo real sobre processos celulares.
- A adesão focal desempenha um papel fundamental na fixação celular e na resposta a estímulos.
Objetivo do Estudo
- Ensinar o funcionamento de um microscópio especializado para estudos com células vivas.
- Demonstrar os efeitos da estimulação mecânica sobre células vivas.
- Fornecer um protocolo detalhado para que pesquisadores possam replicar o estudo.
Métodos Utilizados
- Células expressando proteínas de fusão GFP são cultivadas em placas de vidro.
- A ponta do microscópio de força atômica (AFM) é revestida com fibronectina biotinilada.
- A ponta funcionalizada do AFM é utilizada para criar adesões focais com a superfície celular.
- A estimulação mecânica é aplicada por meio de movimento ascendente controlado da ponta do AFM.
Resultados Principais
- As células reforçaram sua adesão ao substrato após a estimulação.
- Foi observada a reorganização do citoesqueleto de actina em resposta a forças mecânicas.
- A imagem de fluorescência em tempo real capturou respostas celulares dinâmicas.
- O protocolo demonstrou com sucesso a eficácia da técnica.
Conclusões
- O microscópio integrado estuda efetivamente as respostas de células vivas a estímulos mecânicos.
- Este método pode aprimorar a compreensão da mecânica e adesão celulares.
- Aplicações futuras podem incluir a exploração de diversos tipos celulares e condições.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Compreender como as células vivas detectam e se adaptam a forças mecânicas é essencial para reduzir os riscos na validação de alvos em vias de mecanotransdução. Essa abordagem integrada de imagem por AFM e óptica permite a resolução em tempo real e em nível subcelular da dinâmica do citoesqueleto e das adesões, fornecendo confiança preditiva no estágio inicial de descoberta ao associar estímulos mecânicos à reorganização estrutural. O método auxilia na redução de riscos mecanicistas ao permitir a visualização direta do remodelamento da actina induzido por forças e do reforço das adesões focais, orientando decisões de avançar ou não avançar na seleção pré-clínica de alvos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Analisa hipóteses terapêuticas ao revelar como a estimulação mecânica desencadeia a reorganização do citoesqueleto de actina e o fortalecimento das adesões focais.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos por meio da observação direta da dinâmica citoesquelética dependente de força em células aderentes vivas.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao vincular entradas mecânicas a saídas estruturais, reduzindo a ambiguidade no engajamento de alvos mecanossensíveis.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho posteriores, estabelecendo protocolos reprodutíveis para estimulação mecânica e imagem em tempo real.
- Valor Operacional: Aborda a padronização de ensaios e saídas quantitativas por meio de movimentação controlada da ponta do microscópio de força atômica (AFM) e leituras sincronizadas de fluorescência.
- Escalabilidade: Destaca a reutilização da plataforma em diferentes tipos de células aderentes, permitindo avaliação confiável de compostos em campanhas de triagem de mecanobiologia.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Discute a relevância para doenças ao demonstrar o acoplamento estrutural de ápice a base, no qual a estimulação apical induz reorganização em todo o corpo celular.
- Avanço Ajustado ao Risco: Descreve a continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica ao capturar respostas dinâmicas que orientam o alinhamento de biomarcadores em vias de mecanotransdução.
- Redução de Riscos Mecanística: Enfoca o valor preditivo de redução de riscos ao mostrar como a aplicação de força leva à polimerização, despolimerização e agrupamento da actina, esclarecendo o mecanismo de ação.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao continuum de descoberta, desde a testagem de hipóteses até a identificação de compostos líderes, apoiando a compreensão mecanicista antes da triagem de compostos.
- Biologia da Descoberta: Explica como o método auxilia no teste de hipóteses mediante a aplicação de estímulo mecânico controlado e a observação em tempo real da remodelação do citoesqueleto.
- Triagem: Descreve a prontidão do ensaio por meio da formação reprodutível de adesões focais e da imagem quantitativa da dinâmica da actina utilizando modalidades TIRF e confocal.
- Análises: Destaca medições como eventos de polimerização/despolimerização da actina e alterações na intensidade das adesões focais, que permitem comparar estados estimulados e de repouso.
- Pesquisa Translacional: Relaciona o método com a continuidade pré-clínica, demonstrando como a estimulação mecânica apical propaga alterações estruturais através do corpo celular, relevante para a transmissão de forças em nível tecidual.
- Reutilização Empresarial: Apresenta o método como uma capacidade reutilizável para o estudo de alvos mecanossensíveis em modelos celulares vasculares, epiteliais e mesenquimais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos, redução da ambiguidade mecanicista em vias de mecanotransdução.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade da estimulação mecânica e da imagem multi-modal.
- Valor Estratégico: Decisões de avançar/não avançar mais precisas, eficiência no uso de capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados em programas de mecanobiologia.
- Impacto no Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco, com base na observação direta da adaptação celular induzida por forças.
Considerações sobre a Implementação
- Expertise científica necessária em operação de AFM, imagem de células vivas e dinâmica do citoesqueleto.
- Os requisitos de instrumentação incluem sistema integrado de AFM-TIRF-confocal com amortecimento de vibrações e duas câmeras EM-CCD.
- A padronização entre equipes exige adesão ao protocolo para funcionalização da ponta, formação de adesões focais e temporização da estimulação.
- As considerações para adaptação incluem variação na rigidez do substrato, proteínas de revestimento e tipos celulares, mantendo a especificidade da estimulação apical.
- As limitações práticas incluem a sensibilidade a ruídos durante as medições de AFM e a necessidade de condições ambientais controladas para minimizar deriva.
