Microscopia de força de protrusão: Um método para quantificar as forças desenvolvidas pela célula saliências

O objetivo geral deste procedimento é quantificar as forças de protrusão usando microscopia de força atômica. Isso é feito primeiro preparando as grades revestidas com fórmula e medindo a espessura desse filme. A terceira etapa desse processo consiste em assentar as células nas grades e deixá-las aderir.

A etapa final do procedimento é obter imagens do filme sob as células usando microscopia de força atômica. Ao aderir ao substrato, os micrófagos formam estruturas de adesão submicrométricas chamadas podossomos. Por fim, a deformação do filme utilizado pelos podossomos será quantificada e convertida em forças usando um modelo mecânico caseiro.

Coloque uma luz de vidro limpa com etanol no dispositivo de fundição de filme de funil e cubra a parte superior do funil. Colocar a solução de fomvar no funil até que o nível atinja dois terços da lâmina. Deixar agir durante um minuto e depois escorrer a solução de formvar num jato constante.

Observe que a espessura do filme depende tanto da taxa de fluxo quanto da concentração da solução de formvar. Seque esta luz escura e corte retângulos com uma lâmina de barbear afiada. Mergulhe a lâmina em seu copo cheio de água destilada para que o filme fomvar flutue na superfície da água.

Coloque cuidadosamente grades limpas de acetona nos filmes, com a face brilhante para cima com uma lamínula de 12 milímetros de diâmetro em cima de alguns deles. Eles serão usados para o experimento de avaliação de espessura. Eventualmente, mergulhe um slide coberto de adesivos para recuperar todo o filme e as grades.

Contorne a tira coberta de vidro com uma pinça para cortar o formvar e solte-o da lâmina. Monte a localização da grade abaixo do deslizamento coberto e, em seguida, contorne a grade com uma pinça para retirá-la. O orifício no filme fomvar assim criado será fotografado para medir sua espessura.

Monte um nitrato de silício no bloco de vidro AFM, certificando-se de que a faixa dourada não esteja abaixo da ponta da mola. Monte o bloco de vidro no módulo AFM e coloque este último no estágio do microscópio. Coloque a lamínula revestida com fomvar na câmara de observação com PBS por cima.

Digitalize a borda entre fomvar e vidro no modo de contato e com um ponto de 0,5 nano newton. No software de processamento de dados, use a superfície do vidro como referência de altura e meça a espessura do fomvar na seção transversal. Sob um capuz estéril, pegue uma lamínula de 12 milímetros e cole uma tira da fita adesiva sobre ela.

Contorne a grade revestida com uma pinça e coloque-a com a face brilhante para cima, de modo que apenas os lados se prendam ao adesivo. Isso é para evitar que o fomvar seja rasgado ao remover a grade da fita. Coloque a tira de cobertura em uma placa estéril de seis poços e canalize em uma gota de 10 milímetros de meio de cultura livre de soro.

Deve conter aproximadamente 10 mil células e, neste caso, são micrófagos diferenciados dos monócitos humanos. Certifique-se de não tocar na grade com a ponta do flautista no processo, para não danificar o revestimento do fomvar. Incube por meia hora para deixar as células aderirem, depois encha o poço com meio suplementado com soro e incube novamente por duas horas, antes da observação do AFM.

Coloque duas tiras paralelas de fita dupla face em uma placa de Petri com fundo de vidro, certificando-se de que a largura entre elas seja um pouco menor, em comparação com o diâmetro da grade. Em seguida, destaque a grade previamente semeada com células e coloque-a em cima das duas fitas com as células voltadas para baixo. Fixe a grade colocando duas outras tiras em cima das anteriores.

Encha o prato com meio de cultura pré-aquecido suplementado com hepe's. Coloque o prato no aquecedor de pratos previamente ajustado para 37 graus Celsius. Instale o conjunto no estágio AFM.

Quando a temperatura do sistema estiver estável em 37 graus Celsius, prossiga para a varredura da superfície do fomvar, que deve ser realizada no modo de contato, com um ponto de ajuste de 0,95 nano newton e visualize as deformações associadas ao protozoário na janela de visualização de dados de deflexão. Aqui estão os resultados representativos e as etapas de processamento para produzir formações com AFM para as medições gráficas. Como você pode ver nesta imagem, protuberâncias na superfície fomvar são detectadas.

Para converter essas informações fotográficas em valores de força, é necessário primeiro ter acesso à alta diferença local. Para fazer isso, um ajuste polinomial de terceiro grau deve ser subtraído de sua linha de varredura independentemente. Em seguida, o uso de um algoritmo de imagens dedicado caseiro permite avaliar os valores da força de protrusão do mapa de altura do AFM e do modelo mecânico da protrusão mediada por protozoários.

Graças a este procedimento, podemos investigar os mecanismos envolvidos na geração de força de protrusão em protozoários. Obrigado por assistir e boa sorte por seus experimentos.