Pseudofracture: Um Modelo de trauma agudo do tecido periférico

Quando um osso longo, como um fêmur ou tíbia, é fraturado, o músculo lesionado e os tecidos moles ficam expostos a fragmentos ósseos danificados e à medula óssea. Isso é seguido por uma forte resposta imune que auxilia na reparação do tecido. Um modelo para estudar os efeitos dessa exposição pode ser gerado pela coleta de ambos os fêmures e tíbias.

De um camundongo doador. Os ossos são esmagados para criar uma solução óssea, que é então injetada na coxa lesionada de um camundongo receptor. As respostas imunológicas são monitoradas e as lesões em órgãos distantes são avaliadas para estudar os efeitos de longo prazo do trauma induzido por fratura.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes de trauma em tecidos periféricos, como o modelo de fratura bilateral do fêmur, é que este modelo, o modelo de pseudofratura, permite sobrevida de longo prazo sem complicações decorrentes de anestesia prolongada ou técnicas complexas de fixação de fraturas, permitindo assim o estudo das respostas imunológicas em fase tardia após o trauma. Antes de iniciar o procedimento, prepare os seguintes materiais: um balde de gelo, instrumentos cirúrgicos Betadine, pinças hemostáticas GRE, um almofariz e pistilo, pinças, agulhas de 20 calibres, uma seringa de um CC, PBS para anestesia e um cone nasal para isoflurano. Um único animal eutanasiado, pareado por idade e peso.

O camundongo doador genético deve fornecer material suficiente para três receptores. Fixe o doador em uma placa de plexiglás, certificando-se de fixar as extremidades inferiores apenas na ponta do pé. Retire cuidadosamente os pelos das extremidades inferiores.

Em seguida, cubra-os completamente com Betadine e álcool para garantir esterilidade, remova os ossos longos da extremidade inferior, faça uma incisão cirúrgica na pele na região inguinal e continue cortando a pele ao longo de todo o comprimento da extremidade até o tornozelo, retraia a pele e dissecione-a da fáscia subcutânea e do músculo, tanto nos aspectos medial quanto lateral. Em seguida, insira uma lâmina da tesoura sob os músculos que se localizam anterior e lateralmente à tíbia. Deslize a lâmina proximal e distalmente para levantar os músculos limpa e completamente do osso subjacente.

Repita esta técnica na face posterior e medial da parte inferior da tíbia para separar os músculos localizados abaixo da tíbia. Deve-se usar esforço mínimo adicional na face posterior ao deslizar distalmente para quebrar a fíbula longe da tíbia na extremidade proximal desses músculos da perna. Corte os tendões o mais próximo possível de suas inserções e retrate os músculos distalmente, puxando o grupo muscular conjuntamente de forma descendente; um pequeno puxão liberará as inserções distais da articulação do tornozelo, cortando com tesoura através da articulação do tornozelo.

Não desprenda a tíbia do fêmur neste momento, pois essa conexão fornece alavanca adicional que auxiliará na dissecação do fêmur da articulação do quadril. Utilize uma técnica semelhante para soltar os músculos do fêmur. Realize isso posteriormente e, se necessário, tanto medial quanto lateralmente.

Corte a inserção distal desses grupos musculares para liberá-los da articulação do joelho. Estenda a incisão na pele conforme necessário para obter exposição adequada e siga por baixo dos músculos. Para dissecar a extremidade do fêmur fora da articulação do quadril, remova o fêmur e a tíbia ligada do camundongo doador e coloque-os sobre gaze estéril.

Se pare os dois ossos na articulação do joelho simplesmente segurando cada osso com uma mão separada e girando ou rotacionando suavemente os dois ossos em direções opostas ao longo de seus eixos longitudinais. Para remover as inserções tendíneas residuais dos ossos longos, enrole um pedaço de gaze de quatro por quatro ao redor do comprimento do osso. Segure firmemente e raspe todo o comprimento dos ossos várias vezes para remover os tecidos remanescentes da superfície.

Coloque os ossos coletados em um tubo microcêntrifugo estéril de 1,5 mililitro sobre gelo. Transporte os ossos do doador para uma cabine de segurança biológica completamente desinfetada. Para o preparo da solução óssea.

A capela deve ser preparada com um campo estéril, um almofariz estéril e pistilo, uma pinça estéril, um tubo estéril de oito mililitros com PBSA estéril, uma pipeta de um mililitro com ponteiras respectivas. Um micropipetador de 100 microlitros com ponteiras respectivas, seringas de um mililitro e agulhas de calibre 20. Usando a pinça, transfira os ossos para o almofariz e utilize o pistilo para esmagar suavemente os ossos. Pipete um mililitro de PBS no almofariz e continue esmagando os fragmentos remanescentes com movimentos circulares para garantir a completa ressuspensão.

Em seguida, adicione mais um mililitro de PBS e continue triturando para criar a solução óssea, que deve apresentar uma tonalidade rosada. Despeje lentamente a solução do almofariz para o tubo de oito mililitros, garantindo que quaisquer resíduos maiores permaneçam no almofariz. Transfira a solução óssea para uma seringa de um mililitro.

Com uma agulha de 20 gauge, a solução óssea deve permanecer sobre gelo. Pipete um microlitro da solução óssea sobre uma placa Mac congar, espalhando uniformemente sobre a superfície. Incube a placa por 24 a 48 horas para garantir esterilidade.

Inicie o procedimento cirúrgico para lesão de tecido mole e injeção de solução óssea avaliando a profundidade da anestesia de um camundongo anestesiado com pentobarbital por meio do aperto no dedo do pé. Posicione o camundongo em posição supina sobre uma placa de plexiglass e imobilize o animal envolvendo vagamente tiras finas de fita adesiva com o lado adesivo para fora ao redor da porção distal de cada extremidade, utilizando uma tesoura Oscar com lâmina número 40. Depile as regiões abdominal, inguinal e da coxa do animal.

Transfira o camundongo para o campo cirúrgico estéril. Limpe a área cirúrgica com Betadine. Em seguida, limpe com álcool para esterilizá-la.

Coloque um cone nasal no camundongo contendo um pedaço de gaze com um mililitro de isoflurano a 99%. Assim que a respiração do animal começar a desacelerar, remova o cone nasal. Se anestesia adicional for necessária durante qualquer parte do procedimento, pode-se injetar pentobarbital adicional ou administrar mais isoflurano.

Em seguida, dobre um curativo estéril e coloque-o sobre o camundongo, deixando expostos apenas os membros inferiores e a cabeça. Esta lesão de tecidos moles é uma lesão por esmagamento bilateral dos membros posteriores. Certifique-se de que o camundongo esteja posicionado com os membros posteriores ligeiramente abduzidos e rotacionados lateralmente.

Isso auxilia no acesso ao músculo correto. Agrupe os flexores do joelho para realizar a lesão por esmagamento. Prenda um grande hemostato de 18 centímetros ao redor do ponto médio da musculatura posterior da coxa ao longo do fêmur, com sua curvatura convexa voltada para o fêmur. Trave o hemostato fechado apenas no primeiro clique por 30 segundos.

Insira a agulha através da pele por dois a três milímetros, de modo que a ponta do bisel apenas toque o fêmur. Injete 0,15 mililitro da solução óssea na musculatura coxal esmagada de cada lado. Retire a agulha e coloque rapidamente um dedo com luva estéril sobre o local da injeção para impedir qualquer refluxo da solução óssea para fora da ferida.

Mantenha este dedo nesse local por vários segundos. Coloque o camundongo de volta na gaiola e permita total liberdade de movimento assim que a anestesia começar a regredir. Apropriado. Deve-se administrar manejo da dor conforme o camundongo acorda.

Este esquema geral mostra a resposta imunológica bifásica após trauma no ponto temporal de hora zero. O trauma é induzido. Isso é seguido por uma resposta inflamatória hiperaguda inicial que pode ser observada com pico em seis horas e é medida por meio da avaliação da inflamação sistêmica e disfunção de órgãos distantes.

O segundo componente da resposta imunológica pós-traumática é uma imunossupressão tardia, medida pela disfunção das células imunes, e é representada como um vale por volta de 48 horas. Este é um diagrama representativo da resposta de citocinas inflamatórias no plasma que ocorre logo após o trauma e é um exemplo de inflamação sistêmica. A disfunção de órgãos distantes, avaliada por meio de lesão hepática, mostra-se elevada dentro de um período de tempo semelhante.

Este diagrama representativo é um exemplo para destacar a disfunção das células imunes tardiamente após trauma. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de garantir a assepsia e a manipulação precisa durante todo o experimento. Este não é um modelo de fratura verdadeira nem de infecção de ferida.