Um método para isolamento de ilhotas murino e transplante renal subcapsular

O transplante de ilhotas pancreáticas tem sido proposto como um tratamento potencial para o diabetes tipo 1. No entanto, duas limitações importantes impedem que ele se torne uma realidade clínica amplamente difundida. Primeiramente, é necessária uma grande quantidade de ilhotas por receptor.

Como os ilhotas são obtidos de doadores de órgãos, o número de receptores potenciais é severamente limitado. O transplante secundário exige tratamento vitalício com imunossupressores potentes, o que coloca o paciente, especialmente a população pediátrica, em risco de neoplasias, infecções e insuficiência renal. O transplante de ilhotas sob a cápsula renal de camundongos é realizado para investigar estratégias que melhorem os resultados clínicos do transplante.

Islotes pancreáticos isolados de camundongos doadores saudáveis são separados em grupos e preparados para transplante. Em seguida, os islotes são transplantados no espaço subcapsular do rim. Em camundongos receptores diabéticos, a função do enxerto de islotes é avaliada mediante monitoramento dos níveis de glicose sanguínea, o que revela que aproximadamente 250 a 350 islotes restauram a euglicemia em um camundongo receptor de 20 gramas no prazo de 24 horas após o transplante.

A demonstração visual deste método é essencial quanto aos passos para a canulação. O ducto biliar comum e a transferência dos olhinhos para o espaço subcapsular do rim são difíceis de aprender. Esses passos exigem a identificação de estruturas teciduais, mãos firmes e o uso de uma técnica que minimize danos teciduais.

Coloque um camundongo eutanasiado em posição supina sobre uma toalha de papel no microscópio de dissecação e pulverize o abdômen com etanol a 70%. Use uma tesoura para abrir o abdômen com uma incisão em V, da região púbica até as duas patas dianteiras. O camundongo está abaixo do microscópio de dissecação.

Posicione-o com a cabeça voltada para o observador. Localize a entrada duodenal do ducto biliar comum usando uma pinça hemostática, a abertura duodenal do ducto biliar comum. A pinça hemostática deve ser posicionada de modo que, quando comprimida, siga exatamente ao longo da borda entre o pâncreas e o intestino.

Aqui serão demonstrados dois métodos para canular o ducto biliar. O método com a mão livre e o método com auxílio de pinça para canular o ducto biliar. Usando o método com a mão livre, puxe o hemostato fixado no duodeno para longe da cabeça do camundongo em direção à cauda, de modo que o ducto biliar comum fique esticado.

Existe uma confluência no ducto biliar próxima ao fígado, onde a bile drenada da vesícula biliar e as enzimas provenientes do fígado se encontram. Antes de entrar nos intestinos, tracione firmemente o ducto biliar para expor o interior da posição em V. Utilize uma agulha curvada de 27 graus acoplada a uma seringa de cinco mililitros, de modo que a agulha passe exatamente através da posição em V e canule diretamente a porção inferior do ducto. Deslize a agulha vários milímetros além da extremidade do bisel para evitar refluxo para o fígado e a vesícula biliar.

Uma vez que a canulação seja bem-sucedida, perfundir o pâncreas dispensando dois mililitros de liaza da seringa. Observar a expansão do pâncreas sobre o estômago como um indicativo de canulação ideal. Alternativamente, o ducto biliar pode ser canulado.

Utilizando o método da cisterna com pinça. Puxe o hemostato C fixado no duodeno para longe da cabeça do camundongo em direção à cauda, de modo que o ducto biliar comum fique tenso. Em seguida, usando uma agulha curvada de 27 graus acoplada a uma seringa de cinco mililitros, fure a fáscia abaixo do ducto biliar comum, próximo ao fígado.

Use a agulha para remover a fáscia do ducto com a agulha ainda no lugar. Deixe o hemostato de lado e pegue um par de pinças. Use um braço das pinças abertas para sustentar o ducto biliar no local onde a agulha removeu a fáscia, enquanto puxa o ducto e as pinças para frente.

Deslize a agulha para dentro do ducto usando a pinça como apoio. Uma canulação bem-sucedida é indicada por uma expansão uniforme da região do pâncreas sobre o estômago. Uma vez que o pâncreas tenha sido perfundido, remova o hemostato do duodeno.

Em seguida, use a pinça para levantar o duodeno e uma segunda pinça para separar o pâncreas dos intestinos. Depois, puxe o pâncreas soltando-o do topo do estômago e do baço. Por fim, levante o pâncreas para fora do abdômen e corte as conexões restantes com a fáscia que o ligam ao intestino, estômago e baço.

Coloque o pâncreas em um tubo cônico de 50 mililitros e coloque-o sobre gelo. Incube o pâncreas a 37 graus Celsius de acordo com as instruções no protocolo escrito fornecido. Após a incubação, adicione 20 mililitros de meio aos tubos e dissocie o tecido agitando os tubos vigorosamente 40 vezes em 10 segundos.

Esta etapa é crítica para a recuperação ideal de violetas. Centrifugue as células a 800 rotações por minuto. Reconstitua o pellet em 15 mililitros de meio e concentre as amostras.

Despeje a suspensão através de uma malha de arame de 0,419 milímetro e direcione-a para um novo tubo cônico de 50 mililitros. Enxágue o primeiro tubo com mais 10 mililitros de meio contendo 10% de soro bovino fetal e despeje-o através da malha de arame. Peline as células por centrifugação, reconstitua o pellet em cinco mililitros de meio his opaco 10 77 à temperatura ambiente. Em seguida, vortexe suavemente por alguns segundos, adicione mais cinco mililitros de his opaco ao longo da parte interna do tubo para lavar os resíduos da parede do tubo e pipete lentamente para sobrepor 10 mililitros de RPMI livre de soro ao longo da parede do tubo a uma taxa de um mililitro a cada 10 segundos.

Uma interface nítida deve ser evidente. Em seguida, centrifugue as amostras em um rotor de balde oscilante a 20 graus Celsius e 900 vezes a gravidade por 20 minutos com aceleração muito lenta e sem frenagem. Após a centrifugação, as ilhotas serão separadas das células exócrinas utilizando uma pipeta serológica descartável de 10 mililitros. Transfira as ilhotas da interface do meio histo Paque para um novo tubo cônico de 50 mililitros.

Vários tubos podem ser reunidos neste momento para remover o resíduo de olhinhos, substituindo o meio opaco pelos tubos contendo soro e pelotizando as ilhotas por meio da centrifugação dos tubos durante dois minutos a 800 rotações por minuto. Em seguida, ressuspenda as ilhotas em meio fresco. Repita este passo pelo menos duas vezes. Reus.

Suspenda o pellet em cinco mililitros de meio. Coloque uma peneira de células de náilon de 0,1 milímetro virada para baixo sobre um tubo cônico de 15 mililitros. Pipete a suspensão celular através dela para coletar os clios.

Em seguida, enxágue o tubo de 50 mililitros com mais seis mililitros de meio e passe-o através do filtro. Coloque uma gota de três mililitros de meio em uma placa de Petri de 10 centímetros. Inverta o filtro celular e mergulhe-o na gota de meio para coletar os clios; pipete mais cinco a sete mililitros de meio de cultura através do filtro para dentro da placa de Petri.

Para coletar quaisquer eyelets remanescentes do coador sob uma objetiva de quatro vezes, pegue os eyelets individualmente com uma pipeta P 200 e transfira-os para um tubo microfuga de 1,5 mililitro. Essas imagens mostram eyelets isolados de camundongos C 57 black six com 12 semanas de idade. A pureza e a qualidade dos eyelets podem ser estimadas microscopicamente após a conclusão do procedimento de isolamento.

Por exemplo, as duas imagens mostradas aqui exibem um campo representativo onde há presença de detritos e contaminação por células exócrinas. Ao selecionar ilhotes para um experimento, evite escolher células exócrinas contaminantes ou ilhotes que pareçam não saudáveis. Ilhotes com centros necróticos não são saudáveis, como mostrado nesta figura obtida 24 horas após o isolamento; os centros necróticos não serão visíveis imediatamente após o isolamento.

Olhinhos que são células descamadas são inevitáveis e podem ser utilizados no transplante de olhinhos neste vídeo com lapso de tempo de 24 horas. Imediatamente após o isolamento, surgem centros necróticos na maioria dos olhinhos. Esses centros necróticos parecem ser expulsos do olhinho próximo ao final da gravação, durante a coleta dos olhinhos.

Agrupe-os de modo que cada tubo tenha uma distribuição uniforme de qualidade e tamanho dos olhinhos. Por exemplo, cada grupo de 15 olhinhos pode conter quatro olhinhos de tamanho grande, seis olhinhos médios e cinco pequenos. Coloque o tubo no gelo; os olhinhos podem ser usados imediatamente para transplante ou manipulados.

Antes do uso. Coloque uma ponteira estéril para carregamento de gel na abertura de um tubo microfusão de 1,5 mililitro de forma que haja uma curva suave, criando um formato de U na extremidade estreita da ponteira. Ambas as aberturas da ponteira devem estar voltadas diretamente para cima, para fora do tubo microfusão.

Remova cuidadosamente um tubo de olhinhos do gelo. Certifique-se de que todos os olhinhos tenham sedimentado no fundo do tubo. Usando uma pipeta P200, colete suavemente os olhinhos em um volume mínimo do fundo do tubo e transfira-os para a ponta curva preparada.

Após os olhinhos terem sedimentado, remova o máximo possível do meio da ponta aspirando-o através da abertura grande da ponta de carregamento de gel contendo os olhinhos com uma ponta de carregamento de gel nova acoplada a uma pipeta P200. A fixe a extremidade não biselada do tubo à abertura estreita da ponta de carregamento de gel contendo os ilhotas. Em seguida, acople a ponta a uma pipeta P200 e empurre suavemente os ilhotas para dentro do tubo.

Em seguida, conecte a extremidade não biselada do tubo PE 50 à agulha de uma seringa Hamilton de 25 microlitros. Com o êmbolo recuado, pressione o êmbolo da seringa até que os olhinhos estejam a aproximadamente 0,5 centímetros da abertura biselada. Coloque a seringa de lado para que os olhinhos possam se agrupar em uma única massa próxima à abertura biselada do tubo, enquanto o rim é preparado para receber os olhinhos.

Prepare o local cirúrgico aparando os pelos e esfregando a pele com Betadine alternado com álcool isopropílico a 70% por três vezes. Inicie o procedimento de transplante do olhal realizando uma pinça no dedo do pé para confirmar a anestesia no camundongo receptor. Posicione o eixo de uma haste de vidro diretamente sob o camundongo e abaixo do rim, perpendicular à medula espinhal.

Em seguida, localize o rim através da pele e coloque um campo cirúrgico estéril. Uma vez localizado o rim, use a tesoura McFerson banis para fazer uma incisão de dois centímetros através da derme diretamente acima dele, perpendicular à medula espinhal. Essa incisão exporá a parede peritoneal com a tesoura.

Faça uma incisão de um centímetro através da parede peritoneal na mesma direção do corte na camada dérmica, usando o eixo da haste de vidro como suporte posterior, e force o rim através da abertura peritoneal pressionando a superfície adjacente. Umedeça a superfície do rim exposto com PBS estéril gelado usando um aplicador de algodão embebido. Repita o passo a cada poucos minutos conforme necessário para evitar que a cápsula renal seque.

Usando uma agulha de 27 graus, faça uma incisão de 0,2 centímetro através da cápsula renal ao longo da superfície anterior do rim. Movendo-se do lado lateral esquerdo em direção ao lado lateral direito, insira um tubo capilar de vidro puxado na chama. Introduza-o pela incisão feita anteriormente e mova-o em direção posterior ao longo da superfície lateral dorsal do rim.

Para criar uma bolsa entre a cápsula renal e o parênquima renal, mova as orelhas na seringa Hamilton de 25 mililitros preparada até a extremidade da abertura biselada do tubo flexível. Em seguida, insira a borda biselada com o lado voltado para cima na bolsa subcapsular. A borda longa está em contato com o parênquima renal.

Mova o tubo para a extremidade mais posterior da cápsula. Em seguida, transfira lentamente os anéis do tubo de PE 50 para a bolsa subcapsular pressionando o êmbolo da seringa. Conforme os anéis forem preenchendo a bolsa, retire lentamente o tubo flexível para criar mais espaço.

Após remover o tubo do invólucro, deslize a sonda de vidro ao longo da superfície externa do rim, de anterior para posterior, para acomodar suavemente as aberturas na extremidade proximal do invólucro. Usando pinça de braços curvos, levante o revestimento peritoneal adjacente à abertura feita para o rim. Em seguida, use um aplicador de algodão embebido em PBS para empurrar suavemente o rim de volta para a cavidade peritoneal.

Fechamento do camundongo aplicando suturas na parede peritoneal e grampos cirúrgicos na camada dérmica. Retorne o camundongo à sua gaiola e realize a monitorização. Para a recuperação, deve-se fornecer água com acetomineno para o intestino do camundongo.

Olhos de camundongos isolados. Utilizando os métodos descritos neste vídeo, uma dose curativa foi transplantada em camundongos alogênicos C57 Black Six. Os níveis de glicose no sangue sem jejum foram monitorados a partir do primeiro dia pós-operatório.

A rejeição é observada por volta do dia 17 em camundongos receptores de 20 gramas que receberam 300 ilhótas de um doador alogênico aqui. A recuperação foi monitorada em camundongos que receberam 150 ou 300 ilhótas de doadores singênicos. Nenhuma rejeição é observada nesses transplantes, já que as ilhótas são provenientes de doadores singênicos.

A dose administrada de ilhotes mede a função primária dos ilhotos imediatamente após o transplante. Embora tenha sido observada recuperação marginal com 150 ilhotos, a recuperação completa foi observada quando 300 ilhotos foram transplantados. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar as etapas críticas necessárias para isolar ilhotos de camundongo e transplantá-los no espaço subcapsular do rim.

Com a prática, você desenvolverá a capacidade de canular rapidamente o ducto biliar comum, que é a etapa mais difícil deste protocolo.