Análise do genoma usando chip para identificar alvos isoforma específica Gene

O objetivo geral do experimento a seguir é identificar os alvos genômicos da KDM cinco a Jared um, uma histona desmetilase RBB dois. Isso é alcançado pela preparação de cromatina reticulada que é sonicada para produzir fragmentos de DNA do tamanho apropriado como segundo passo. Fragmentos de DNA ligados ao RBB dois são imunoprecipitados com anticorpos contra RBB dois.

Em seguida, o DNA genômico recuperado é amplificado por PCR para sequenciamento. Por fim, as leituras curtas sequenciadas pela Illumina são alinhadas de forma única ao genoma humano, e picos significativos são identificados e anotados aos genes mais próximos. Para identificar os dois genes alvo da Rbbb, são obtidos resultados que mostram funções moleculares associadas aos genes alvo da Rrb B dois com base na identificação em todo o genoma de regiões enriquecidas para Rbbb dois.

Olá, eu sou Mike. Ela do laboratório da Dra. Elizabeth Bencia, do Departamento de Bioquímica e Genética Molecular da Universidade de Illinois em Chicago. E eu sou ala do laboratório de genômica biomédica, liderado pela Dra. NGA, no Parque de Pesquisa Biomédica BARCEL, Universidade PO P fea.

E eu sou Danielle Dal. E eu sou William Richter. Ambos também estamos no Laboratório de Habilidades de Benevolência.

Hoje vamos mostrar um procedimento para imunoprecipitação da cromatina e sequenciamento. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar o sítio de ligação de sua dermatologista. Então, vamos começar.

Para iniciar este procedimento, cultive aproximadamente 10 elevado à oitava potência células. Para cada imunoprecipitação ou IP. Aqui, linfoma osteolítico difuso.

Células U 9 37 são utilizadas e induzidas à diferenciação monocítica com TPA por 96 horas após o crescimento celular. Adicione solução de formaldeído diretamente ao meio para obter uma concentração final de 1%. Em seguida, agite levemente o frasco e deixe repousar à temperatura ambiente por 10 minutos. Após isso, aspire o meio e lave as células com 15 mililitros de PBS gelado. Repita essa lavagem uma vez.

Em seguida, adicione seis mililitros do tampão de lise um a cada um dos frascos sobre gelo. Em seguida, agite suavemente os frascos por 20 minutos a quatro graus Celsius. Por fim, recolha as células utilizando uma espátula celular e transfira-as para tubos cónicos de 15 mililitros.

Neste ponto, as células podem ser armazenadas a menos 80 graus Celsius. Se as células foram congeladas, descongele-as. Após o descongelamento, centrifugue as células e descarte o sobrenadante.

Em seguida, ressuspenda as células em seis mililitros do tampão de lise dois e agite suavemente os tubos à temperatura ambiente por 10 minutos. Repita a centrifugação e ressuspenda as células em 2,5 mililitros do tampão de lise três. A seguir, prepare a suspensão para sonicação colocando-a em um béquer com água gelada, utilizando a microponta de um sonicador Branson 450 ajustado entre 50 e 60% de amplitude.

Sonicar a solução por uma rajada constante de 32 segundos e resfriar em gelo. Repetir esses pulsos de 10 a 15 vezes durante um minuto, depois pipetar o conteúdo do tubo para cima e para baixo e transferi-lo para um novo tubo. Continuar a aplicar pulsos e resfriar a solução.

Cinco vezes adicionais após a sonicação, adicione Triton X-100 a 10% a um décimo do volume da solução. Em seguida, transfira os lisados para tubos de centrífuga de 1,5 mililitro e centrifugue os detritos em uma microcentrífuga antes da imunoprecipitação de cromatina ou análise por chip. Reserve 50 microlitros do lisado celular como amostra de entrada.

Em seguida, combine o lisado celular clarificado com as microesferas Dyna ligadas ao anticorpo que haviam sido previamente preparadas conforme descrito no protocolo escrito. Incube a mistura juntamente com a amostra de entrada de 50 microlitros a quatro graus Celsius durante a noite. Lave as microesferas com um mililitro de tampão de lavagem.

Em seguida, utilize um suporte magnético para recolher as microesferas e remover o sobrenatante. Repita essa lavagem de seis a oito vezes. Realize uma lavagem final com um mililitro de TE contendo 50 milimolares de cloreto de sódio.

Centrifugue as microesferas em uma microcentrífuga após a centrifugação e aspire qualquer tampão TE residual. Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão de eluição às amostras. Imediatamente após.

Incube as amostras a 65 graus Celsius por 10 a 15 minutos. Risque os tubos contra um suporte para tubos de 1,5 mililitro a cada dois minutos para manter as esferas em suspensão. Colete as esferas por centrifugação e com o suporte magnético e transfira o SNAT para um tubo de PCR.

Em seguida, recupere a amostra de entrada previamente armazenada e adicione três volumes do tampão de eluição. Por fim, coloque as amostras de IP e de entrada no termociclador durante a noite a 65 graus Celsius. No dia seguinte, para reverter as ligações cruzadas, adicione um volume de tampão TE às amostras.

Em seguida, adicione os RNAs A até uma concentração final de 0,2 microgramas por microlitro. Incube as amostras no ciclador térmico por uma a duas horas a 37 graus Celsius. Após a incubação, adicione proteinase K até uma concentração final de 0,2 microgramas por microlitro.

Em seguida, incubar as amostras no ciclador térmico a 55 graus Celsius por duas horas. Depois, extrair as amostras uma vez com um volume de fenol. Extrair as amostras pela segunda vez com um volume de álcool isoamílico fenil clorofórmico.

Finalmente, extraia as amostras mais uma vez com um volume de clorofórmio-álcool isoamílico. Em seguida, adicione 30 microgramas de glicogênio a cada amostra. Adicione também cloreto de sódio até uma concentração final de 0,2 molar e dois volumes de etanol às amostras.

Incube-os por 30 minutos a menos 80 graus Celsius. Após a incubação, centrifugue as amostras e remova o sobrenadante. Lave os pellets com 500 microlitros de etanol 75%, depois seque os pellets e os ressuspenda em 40 microlitros de água.

Para verificar o tamanho dos fragmentos de DNA produzidos pelo procedimento de SONICAÇÃO, carregue cinco microgramas da amostra de entrada purificada em um gel de agarose a 1,8% e execute a eletroforese. O procedimento de sonicação deve produzir fragmentos na faixa de 150 a 350 pares de bases. No entanto, se os fragmentos não estiverem nessa faixa, o procedimento de sonicação deve ser ajustado variando o número de pulsos e a amplitude antes da amplificação do DNA genômico.

Verifique o tamanho, a concentração e o enriquecimento das amostras conforme descrito no protocolo escrito. Para iniciar a amplificação do DNA genômico, obtenha 34 microlitros da amostra de IP e 200 nanogramas da amostra de entrada. Realize e repare a adição de cauda poli-A e a ligação de adaptadores aos fragmentos de DNA utilizando um kit de preparação de amostras de DNA genômico Illumina, conforme descrito no protocolo escrito.

Purifique o DNA utilizando um kit de purificação PCR mini elute e, em seguida, elua-o em tampão EB pré-aquecido a 50 graus Celsius. Utilize 23 microlitros e 46 microlitros para as amostras de DNA de IP e de entrada, respectivamente. Prepare a reação de PCR usando 23 microlitros de DNA com adaptadores, 25 microlitros de fusão e DNA polimerase do kit.

Um microlitro de vinte micromolar do PCR único um e um microlitro de vinte micromolar do PCR único dois; realize a reação de PCR conforme descrito no protocolo escrito. Após a amplificação por PCR, purifique o DNA com o kit de purificação de PCR Qiagen mini loop.

Pré-aqueça 15 microlitros do tampão EB a 50 graus Celsius e dilua o DNA diluindo 0,5 microlitros da amostra de um para quatro e realize uma leitura em NanoDrop para purificar os produtos amplificados. Prepare um gel de AGAROSE 1,8% de 50 mililitros usando água grau HPLC, adicione TAE e brometo após a agarose ter derretido. Em seguida, despeje o gel e carregue o gel.

Após adicionar quatro microlitros de tampão de carregamento às amostras de entrada e IP, execute o gel a 120 volts durante 45 minutos. Analise o gel após a eletroforese. Os resultados devem revelar que fragmentos na faixa entre 150 e 350 pares de bases são produzidos.

Eles representam fragmentos de DNA genômico com comprimento entre 50 e 250 pares de bases. E um adaptador recorta a região do gel contendo o material na faixa de 150 a 350 pares de bases com um bisturi. Tenha cuidado para evitar recortar a faixa do adaptador, que migra em aproximadamente 120 pares de bases.

Recupere o DNA utilizando um kit rápido de extração de gel kayak, conforme as instruções do fabricante. Seque a amostra até exatamente 11 microlitros em um speed vac sem aquecimento. Remova um microlitro da amostra e meça a concentração de DNA utilizando um espectrofotômetro NanoDrop.

Por fim, identifique produtos gênicos enriquecidos utilizando o analisador genômico Illumina e analise os sítios de ligação e genes alvo conforme descrito no protocolo escrito. As coordenadas genômicas das regiões enriquecidas de ligação da proteína RB dois ou ligação de RBP dois são apresentadas em formato organizado por cromossomo. As ocupações dos genes do conjunto nos cromossomos podem ser visualizadas como VARs pretos.

Aqui, as ocupações do cromossomo 10 são mostradas; duas regiões de ligação do RBP dois são indicadas por linhas verticais. O painel central mostra todas as regiões de ligação das isoformas do RBP dois no cromossomo 10, e o painel inferior mostra as regiões de ligação da isoforma grande do RBP dois. Essas informações fornecem uma visão geral das ocupações sobrepostas e específicas das isoformas do RBP dois no cromossomo 10.

Aqui é mostrado um mapa de calor com as categorias de função molecular da ontologia genética (GO) significativamente enriquecidas, corrigidas pela taxa de falsa descoberta (FDR), entre os genes ligados ao RBP. Duas cores tendendo ao vermelho indicam alta significância estatística. O amarelo indica baixa significância estatística, e o cinza indica ausência de significância estatística.

A análise de enriquecimento mostra as funções moleculares sobrepostas e específicas de isoformas dos genes-alvo do R BP dois. Acabamos de mostrar como identificar sítios de ligação de fatores de transcrição durante este procedimento. É importante produzir fragmentos de DNA na faixa de tamanho apropriada e com rendimento adequado.

Isso pode ser alcançado seguindo nossas orientações durante a etapa de SONICAÇÃO. É isso aí. Boa sorte com seus experimentos e obrigado por assistir.