A Novel Bayesiana Algoritmo de Mudança-ponto para Genome-wide Análise de tipos de dados ChIPseq Diversos

O objetivo geral do experimento a seguir é utilizar a densidade das posições de leitura mapeadas provenientes de dados de sequenciamento de imunoprecipitação de cromatina para estimar a densidade média a posteriori das leituras ao longo do genoma. Isso é alcançado por meio do pré-processamento. As leituras de ChIP-seq mapeadas são convertidas em perfis de densidade segmentados, com o mesmo número de leituras caindo em blocos não sobrepostos de 200 pares de bases.

Quaisquer bins adjacentes com a mesma densidade são mesclados em um bloco maior como um segundo passo; posteriormente, as densidades médias posteriores de cada bloco são calculadas recursivamente dentro do contexto de todos os blocos circundantes, utilizando um modelo bayesiano com filtros direto e reverso. Nesse modelo, a contagem de leituras para um bloco é descrita por uma distribuição de Poisson com um parâmetro theta que assume uma distribuição a priori gama com parâmetros alfa e beta. Em seguida, as estimativas da densidade média posterior de cada bloco são avaliadas quanto à significância com base em se excedem ou não o quantil 90 em relação à densidade de fundo do controle de entrada, a fim de gerar os segmentos genômicos enriquecidos finais. São obtidos resultados que ilustram a progressão desde as leituras sequenciadas brutas até as estimativas de densidade média posterior das leituras e, finalmente, as ilhas enriquecidas em dados de ChIP-seq durante a análise BCP.

Além disso, os resultados mostram que o BCP supera uma ferramenta concorrente, o cer. A principal vantagem dessa técnica em relação a métodos existentes, como o CER, é que o BCP utilizou os avanços mais recentes em modelos de marcadores ocultos, permitindo caracterizar melhor as nuances da análise de dados chipsy do que os métodos heurísticos anteriores. Este método pode auxiliar em questões fundamentais no campo da epigenômica, como o papel das modificações histônicas por meio da caracterização de seus padrões de enriquecimento em todo o genoma.

Embora este método cuidadoso possa fornecer insights na análise de dados de ChIP-seq, a estrutura básica também pode ser aplicada à análise de outros dados de sequenciamento de nova geração, como a identificação de regiões diferencialmente metiladas em dados de sequenciamento bisSulfi, locos transcricionais novos em RNA-Seq, variação no número de cópias ou qualquer tipo de dados de microarranjo em mosaico. A demonstração visual deste método é fundamental para a compreensão clara da metodologia e de suas vantagens. As vantagens teóricas estão ocultas dentro do software.

Todos os passos do procedimento demonstrados aqui foram agrupados em um único executável no pacote de software BCP, que está disponível para download neste vídeo. Os passos executados pelo programa são descritos para executar o software. Três parâmetros são necessários.

Um arquivo contendo leituras exclusivamente mapeadas de uma amostra de chip e um arquivo semelhante para leituras de controle de entrada, bem como um nome de arquivo de saída para preparar os arquivos de entrada para a análise BCP. Primeiro, alinhe as leituras curtas produzidas a partir de corridas de sequenciamento ao genoma de referência apropriado utilizando o software preferido de alinhamento de leituras curtas. As localizações mapeadas devem ser convertidas para o formato de dados extensível do navegador, ou BED, de seis colunas, com uma linha separada por tabulação para cada leitura mapeada indicando a posição inicial do cromossomo mapeado, posição final, nome da leitura, pontuação e fita.

Estenda o chip e as localizações do mapa de entrada para um comprimento de fragmento predeterminado. Por exemplo, o tamanho do fragmento visado durante a digestão enzimática ou sonicação do DNA, geralmente em torno de 200 pares de bases. As contagens de fragmentos são então agregadas em caixas adjacentes.

Por padrão, o tamanho do bin é definido como o comprimento estimado do fragmento de 200 pares de bases. Qualquer ponto de mudança possível em um conjunto de bins com contagens de leitura idênticas provavelmente ocorrerá nas bordas mais externas. Assim, é improvável que um ponto de mudança ocorra em uma borda interna entre dois bins com as mesmas contagens de leitura.

Portanto, agrupe os compartimentos adjacentes com leituras idênticas por compartimento em um único bloco. Após preparar os arquivos de entrada, invoque a estimativa BCP digitando simplesmente o comando mostrado na parte inferior da tela. A densidade de leituras de cada bloco é modelada como uma distribuição de Poisson com um parâmetro médio theta seguindo uma mistura de distribuições gama com parâmetros alpha e beta e uma probabilidade a priori de ocorrência de um ponto de mudança em qualquer bloco.

O limite de P condicionando cada bloco desta forma efetivamente resulta em um modelo oculto de Markov infinito ou HMM. Os hiperparâmetros alfa, beta e P são estimados usando a máxima verossimilhança a posteriori. As estimativas bayesianas são explicitamente calculadas para cada bloco theta sub T como a expectativa de theta sub T dado y sub T; os filtros tradicionais, porém mais demorados, para frente e para trás, frequentemente usados em HMS, são substituídos pela aproximação de mistura de complexidade limitada, mais eficiente computacionalmente, para estimar as médias a posteriori theta chapéu sub T. As médias a posteriori resultantes serão suavizadas em um perfil aproximadamente constante por partes, de modo que blocos com theta chapéu sub T idênticos devem ser agrupados novamente, com coordenadas de limite atualizadas.

O BCP utiliza o número de leituras de entrada por bloco como taxa de fundo e determina o enriquecimento. Utiliza um teste de hipótese simples com base em se a densidade média da posição do chip para um bloco excede um determinado limiar de significância. O quantil de 90% é o limiar padrão e é apropriado na maioria dos casos.

O BCP então mescla blocos adjacentes de densidade média posterior que excedem o enriquecimento em uma única região e relata as coordenadas mescladas no navegador. O formato de dados extensível BCP é excelente em identificar regiões de enriquecimento amplo em dados de modificação de histona. Aqui, os resultados do BCP são comparados aos do cser, uma ferramenta existente que demonstrou alto desempenho; trabalhos anteriores deste laboratório estudando a trimetilação da H três K 36 demonstraram uma tendência a tamanhos muito maiores de ilhas no BCP do que no cer.

Ilhas maiores estão mais de acordo com a expectativa convencional de ilhas amplas e difusas de enriquecimento por trimetilação de H três K 36. Ilhas maiores isoladamente não indicam precisão. Portanto, a associação conhecida entre ilhas de trimetilação de H três K 36 e regiões gênicas ativamente transcritas, bem como sua exclusividade mútua com ilhas de trimetilação de H três K 27, foi utilizada para avaliar o desempenho do BCP e do CER em comparação com o CER. O BCP identificou ilhas contíguas maiores que representam melhor os corpos gênicos, sem comprometer o aumento da sobreposição com ilhas de trimetilação de H três K 27.

O BCP mantém a alta sobreposição de genes ativos por ilhas de trimetilação da H3K36 com limites alinhados de forma estreita aos corpos gênicos, sem aumentar o grau de sobreposição falso-positiva com genes do espaço intergênico que apresentam transcrição reprimida ou a marca repressora de trimetilação da H3K27. Ao avaliar a reprodutibilidade das chamadas de ilhas pelo BCP em dois conjuntos de dados replicados, observou-se que o BCP não apresentava uma forte dependência da profundidade de cobertura de leituras, ao contrário do algoritmo concorrente Cser. Evidências adicionais da robustez e reprodutibilidade do BCP são fornecidas pelo exame de regiões distintas adicionais, demonstrando limites de ilhas consistentes apesar da reduzida profundidade de cobertura. Para demonstrar plenamente a versatilidade do BCP, obteve-se um amplo espectro de dados de modificações histônicas, incluindo as marcas pontuadas de acetilação da H3K27, acetilação da H3K9 e trimetilação da H3K4, bem como a marca difusa de trimetilação da H3K9, além da trimetilação da H3K27 e da trimetilação da H3K36. Esses conjuntos de dados foram analisados utilizando as configurações de parâmetros padrão tanto para o BCP quanto para o Cser.

No centro, observa-se o enriquecimento pela trimetilação da H3K36 no gene PXDN, marcando a transcrição ativa; como esperado, no local de início da transcrição, encontram-se marcas ativas pontuais adicionais: acetilação da H3K27, acetilação da H3K9 e trimetilação da H3K4. Logo a jusante do PXDN, há um espaço intergênico reprimido marcado pelo enriquecimento da trimetilação da H3K27; na margem oposta, localiza-se um gene reprimido com trimetilação da H3K27. Avançando mais um passo para fora.

Nossa cromatina silenciada, indicada pela presença de enriquecimento de trimetilação de H três K nove, parece indicar o silenciamento de SN TG dois e MYT um L, talvez de forma menos transitória do que a repressão por trimetilação de H três K 27. Esta região abrange a maioria dos fenômenos encontrados no ChIPseek de modificações histônicas. Ela ilustra como a natureza dinâmica do BCP pode identificar marcas pontuais de acetilação e trimetilação de H três K quatro, ao mesmo tempo em que distingue grandes ilhas contíguas de repressão por trimetilação de H três K 27 e trimetilação de H três K nove, bem como a trimetilação de H três K 36 associada à transcrição ativa.

Este algoritmo pode ser realizado em aproximadamente 30 minutos, dependendo do número de leituras e do resultado dos sinais do genoma. Nenhuma otimização significativa é necessária, como frequentemente ocorre com outros métodos, após seguir este procedimento. Muitas proteínas-alvo diferentes da imunoprecipitação da cromatina podem ser estudadas usando o BBCP, incluindo várias outras modificações de histonas, bem como fatores de transcrição ligantes de DNA, para responder perguntas adicionais sobre mecanismos epigenômicos e regulação gênica.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como o BCP é usado para identificar regiões acessíveis a marcas difusas de histonas na análise de dados de chipsy.