Remendo Recordings Grampo de neurônios da retina do rato em um Preparação Slice Dark-adaptados

Nossa experiência visual começa quando o pigmento visual nos fotorreceptores da retina absorve fótons de energia luminosa, levando eventualmente ao fechamento de canais ativados por nucleotídeos cíclicos na membrana celular. Isso suprime a liberação do neurotransmissor glutamato tanto por bastonetes quanto por cones. O glutamato liberado é detectado por células retinianas downstream para o estudo dos sinais subsequentes.

Os olhos são removidos de um camundongo eutanasiado. Os S são isolados, embutidos em um bloco de ágar e cortados utilizando um micrótomo vibratório. Em seguida, os cortes retinianos são colocados sob um microscópio e estimulados com iluminação por LED.

Enquanto os registros de patch clamp são realizados para medir as correntes ou potenciais sinápticos gerados, geralmente indivíduos novos nesse método enfrentam dificuldades devido às complexidades adicionais de trabalhar no escuro. Assim, poder visualizar todo o processo proporcionará uma sensação que, de outra forma, seria difícil de descrever.

Inicie este procedimento revestindo os eletrodos de fio de gravação e de referência que serão utilizados com uma camada de cloreto de prata. Mergulhe os eletrodos em cloreto de sódio um molar. Em seguida, utilizando uma fonte de alimentação de 15 volts com uma onda senoidal de um hertz, aplique 15 volts entre eles por cerca de 20 segundos.

Usando um puxador de micropipetas, prepare pipetas de patch a partir de vidro de sílica BO polido a fogo, escolhendo uma resistência da ponta da pipeta com base no tamanho das células-alvo para corpos celulares com cerca de 20 mícrons de diâmetro. Utilize uma pipeta com resistência da ponta entre cinco e 10 megaohms para corpos celulares. Após cerca de cinco mícrons de diâmetro, use uma resistência da ponta entre 12 e 15 megaohms.

Para preparar os eletrodos de referência de terra, use uma seringa para encher tubos de polietileno com uma solução de ágar a 3,5% preparada em cloreto de sódio de um milimolar. Em seguida, prepare as seguintes soluções de acordo com as instruções no protocolo escrito anexo. Solução externa de banho, solução de corte, solução interna da pipeta de aspartato de potássio e o suporte traseiro de ágar.

Armazene todas as soluções a quatro graus Celsius até o momento de utilizá-las. No dia do experimento, retire cerca de 1,5 mililitros de solução interna de aspartato de potássio. Em seguida, adicione Fluor diluído.

Despeje cerca de 50 mililitros de meio aims contendo bicarbonato de sódio no recipiente de armazenamento opaco à luz. Conecte a tubulação de plástico a um tanque de gás contendo 5% de dióxido de carbono e 95% de oxigênio para equilibrar o meio aims com o gás e, em seguida, coloque o recipiente em um banho-maria a 30 a 32 graus Celsius. Em seguida, encha um frasco com 110 mililitros do meio aims contendo he pas e coloque-o sobre gelo.

Iguale o meio borbulhando a solução com gás oxigênio a 100%. Coloque o meio aimes restante contendo bicarbonato de sódio em um reservatório aquecido sobre a gaiola de Faraday. Envolva o tubo e a tampa da garrafa com parafina para aprisionar o gás no espaço acima da solução e equilibrar com gás carbônico a 5% e oxigênio a 95%.

Usando um tubo de dispersão de ar de vidro, prepare 3% de agarose de baixa temperatura de gelificação adicionando 0,75 gramas a 25 mililitros de meio aims com aquecimento intenso. A solução atinge cerca de 115 graus Celsius durante a agitação. Quando a solução ficar límpida e sem bolhas, coloque a solução de agarose fundida em um banho-maria a 42 graus Celsius.

Monte a câmara de gravação no microscópio invertido. Deslize uma ponte de ágar de cinco centímetros sobre o eletrodo de referência de prata, cloreto de prata e posicione-a na câmara de gravação. A resistência da ponta do micropipeta pode ser medida preenchendo-se uma micropipeta com solução interna, colocando-a no suporte do micropipeta, posicionando o suporte no estágio de cabeçote do amplificador e abaixando a micropipeta na solução; para preservar o pigmento visual durante as gravações fisiológicas, todos os procedimentos devem ser realizados sob luz infravermelha utilizando óculos de infravermelho, mas todos os procedimentos serão mostrados aqui sob luz ambiente.

Após a eutanásia do camundongo, use uma tesoura curva para remover rapidamente os olhos. Coloque os olhos sobre um pedaço de papel de filtro para impedir que rolem. Em seguida, segure um olho no lugar com uma pinça e use uma lâmina fina de dupla face para fazer um corte na córnea.

Assim que o globo ocular for perfurado, transfira o olho para uma placa de Petri de 60 milímetros cheia com meio aims. Usando o corte na córnea como ponto de entrada, utilize uma tesoura pequena para remover as porções restantes da córnea.

Em seguida, remova o cristalino e o humor vítreo, garantindo que a retina permaneça aderida à cúpula ocular. Coloque-a em um recipiente opaco à luz, preenchido com meio AMS equilibrado com 5% de dióxido de carbono em 95% de oxigênio a 32 graus Celsius.

Em seguida, corte o hemisfério secundário de uma das cúpulas oculares usando uma lâmina de bisturi número 10. Separe a retina do epitélio pigmentado da retina.

Remova as bordas da retina para permitir que o tecido fique plano. Use uma pipeta de vidro pequena para massas com uma bolsa de látex para encher uma placa de Petri de 35 milímetros com ágar fundido de baixa temperatura de gelificação e arraste a pinça através do ágar para testar sua consistência. Assim que o ágar começar a solidificar, transfira a retina para o topo do ágar.

Em seguida, sem tocar na retina, use um pedaço de papel absorvente torcido para absorver a solução em excesso ao redor dela. Coloque duas a três gotas adicionais de ágar diretamente sobre a retina e rapidamente posicione um cilindro de plástico para formar uma parede ao seu redor, mantendo a retina próxima ao centro do cilindro; acrescente mais ágar derretido gota a gota, transfira a placa de Petri para um banho de gelo com água para resfriar. Após 30 segundos, retire o tecido e use um êmbolo para extrudir o bloco de ágar, empurrando a partir do lado mais distante da retina.

Use uma lâmina de barbear de um lado para recortar um pequeno bloco de ágar contendo a retina e fixe o bloco com cola instantânea contra o anteparo de ágar no disco de espécime. Transfira o disco de espécime para o suporte do microtomo vibratório e despeje abundantemente solução AIM gelada no suporte, deixando o bloco com a retina completamente submerso. Corte fatias da retina com espessura de cerca de 200 mícrons usando a taxa máxima de vibração da lâmina e uma velocidade de avanço da lâmina ajustada de modo que leve de quatro a cinco segundos para cortar completamente a retina.

Use uma lâmina de bisturi número 11 para cortar cada fatia utilizável do bloco, uma de cada vez. Coloque as fatias contendo a retina em câmaras de registro e fixe-as. Usando os suportes para fatias, os fios de náilon cruzam o suporte para fatias.

Segure o agar ao redor da retina, deixando a retina desobstruída. Para gravações. Transfira a câmara de gravação para a platina do microscópio ereto.

Feche a cortina e ligue a fonte de luz infravermelha para visualizar o corte em uma câmera sensível ao infravermelho. Sob o microscópio, identifique um corte retiniano com fotorreceptores intactos no ângulo de corte apropriado. Algum dano superficial pode ser evidente devido ao processo de corte.

Usando uma pipeta com a ponta quebrada, aspire suavemente os corpos celulares mortos. Para remover essa camada fina de células, uma vez revelada uma camada saudável de células vivas, identifique um corpo celular cuja posição esteja localizada na camada de interesse. Mova a ponta da pipeta de modo que ela afunde levemente a membrana celular e aplique pressão negativa ou interna suave para formar um selo de alta resistência. O modo de célula inteira pode ser alcançado aplicando-se pressão negativa ao eletrodo para romper a célula.

Em seguida, estimule o tecido retiniano com luz utilizando LEDs para evocar respostas. Ao final da gravação, capture uma imagem usando a luz de excitação apropriada para o Fluor que se difundiu para dentro da célula a partir da solução interna da pipeta. Aqui, são mostrados os potenciais evocados pela luz de um neurônio retiniano adaptado à escuridão em resposta a flashes de luz de intensidade crescente.

Esta figura é uma imagem de fluorescência obtida a partir de um corte de retina no qual as células foram preenchidas com o corante Fluor Amarelo de Lucifer; a fluorescência induzida mostra a morfologia das células das quais foram realizados os registros em configuração de patch. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma compreensão mais clara de algumas das complexidades envolvidas na realização de registros com microeletrodo de adesão em cortes de retina adaptados à escuridão. O objetivo deste procedimento é medir respostas induzidas pela luz sob iluminação controlada.

Para fazer isso, precisamos primeiro isolar a retina, embuti-la em ágar e, em seguida, preparar fatias retinianas das quais podemos obter gravações de células isoladas.