Patch-clamp medidas de capacitância e Ca ^{2 +} Imaging nos terminais nervosos da retina único em Fatias

O objetivo geral deste procedimento é preparar fatias de retina embebidas em ágar para o estudo dos microcircuitos localizados nos terminais nervosos pré-sinápticos das células bipolares. Isso é realizado primeiramente obtendo-se a retina de um olho de peixe-dourado adaptado à escuridão e cortando-se um pequeno pedaço retangular dessa retina. O fragmento retiniano é então imerso em uma solução transparente de ágar de baixo ponto de fusão, a qual é posteriormente solidificada em uma solução de corte agradavelmente fria.

O próximo passo é fatiar o bloco de ágar sólido contendo o pedaço retangular de retina utilizando um vibratomo. O passo final é visualizar, identificar e realizar a perfusão. Prenda o terminal nervoso de uma célula bipolar.

Por fim, os resultados demonstram a corrente pré-sináptica de cálcio e a exocitose física sináptica com medidas de capacitância da membrana em terminais de células bipolares atomizados e intactos. Olá, meu nome é Han Kim. Sou pós-doutorando no laboratório de PCO do Instituto Burham.

Hoje vou apresentar a preparação de fatias embutidas em AGA da retina fria de peixe dourado e demonstrar a medida de capacitância por clamp de patch em um único terminal. Para iniciar este procedimento, remova cada olho de um peixe dourado cortando uniformemente ao redor da parte frontal do olho com uma tesoura de mola. Em seguida, coloque as cúpulas oculares em solução para fatiamento gelada sem cálcio.

Se necessário, remova a lente com pinça. Em seguida, remova o epitélio pigmentado aderido à retina destacando a retina do copo ocular com uma pinça fina de ponta em ângulo de 45 graus. Depois disso, corte o nervo óptico com uma pinça fina ou com uma tesoura de mola.

Em seguida, aplique sucção com uma pipeta de pasta modificada ou uma pipeta de transferência com ponta grande. Para remover a retina, retire suavemente o restante do epitélio pigmentar aderido à retina. A superfície da retina limpa e saudável deve apresentar-se lisa.

Em seguida, trate a retina isolada com cerca de 0,03% de IDE mais alta durante 15 a 30 minutos à temperatura ambiente. Para remover o humor vítreo, observe que o procedimento deve ser realizado com pouca luz. Na próxima etapa, corte um pedaço retangular de retina de aproximadamente dois por dois milímetros, que contenha toda a espessura da retina, removendo as bordas curvas com uma lâmina de barbear.

Em seguida, transfira o fragmento retiniano para um recipiente pequeno contendo solução de ágar e tente minimizar a quantidade de solução ao redor da retina ao colocá-la no ágar líquido. Posteriormente, imerja a retina com o ágar diretamente na solução de corte gelada para solidificar o ágar. Em seguida, corte o bloco de ágar sólido, contendo o fragmento retiniano retangular, em um cubo de um por um por um centímetro.

Cole o bloco na superfície da placa de corte na câmara de corte pré-fria. Em seguida, corte o bloco em fatias com espessura de 200 a 250 micrômetros na solução de corte gelada. Utilizando um vibrátomo, pode-se obter um total de cinco a dez fatias, que permanecem viáveis por cerca de cinco a seis horas.

Em seguida, transfira uma das fatias para a câmara de registro. Coloque um suporte de platina em forma de U com uma grade de fios de náilon sobre a fatia. Perfuse a fatia continuamente, à taxa de um a dois mililitros por minuto, com solução de registro borbulhada com carbogênio.

Neste passo, utilize uma seringa com ponteira de filtro de 0,2 mícron para encher a pipeta de vidro com a solução interna até um nível de um a dois centímetros da extremidade posterior da pipeta. Em seguida, remova as bolhas de ar da ponteira posteriormente. Fixe a pipeta no suporte.

Aplique pressão positiva à pipeta e mova-a em direção ao terminal alvo usando um micromanipulador, ao mesmo tempo em que move a ponta para baixo através do corte. Mova a pipeta em direção lateral varrendo para garantir que o corte não seja puxado junto com a ponta. Em seguida, mova a ponta da pipeta ao redor do terminal para limpar a superfície da membrana.

Empurre a ponta para baixo contra a borda do terminal para criar uma reentrância e liberar a pressão positiva. Se um selo giga ohm não se formar imediatamente, aplique uma leve pressão negativa à pipeta. Após a formação do selo giga ohm, mude o amplificador de grampo de potencial E PC nine para o modo de gravação emsell e altere o potencial de retenção para menos 60 ou menos 70 milivolts.

Aplique a correção rápida da capacitância e aguarde a estabilização do selamento entre cinco e dez gigaohms. Em seguida, rompa a membrana com sucção acentuada e suave. Para estabelecer a configuração de gravação em célula inteira.

Você também pode usar sucção bucal em vez de uma seringa. Após a configuração de célula inteira ter sido estabelecida sobre um terminal de MB atomizado, aplique uma despolarização em degrau de 200 milissegundos, de menos 70 a zero milivolts. Lembre-se de que uma onda senoidal de dois quilohertz no modo de fixação de voltagem é aplicada antes e depois dessa despolarização, a fim de medir a capacitância da membrana; a despolarização permite a medição direta das correntes de cálcio internas ativadas pela abertura de canais de cálcio do tipo L ativados por voltagem, utilizando uma solução interna à base de césio.

Paralelamente, é possível monitorar o salto na capacitância causado pela exocitose dependente de cálcio das vesículas sinápticas, o que aumenta a área da superfície da membrana. Se uma célula bipolar MB intacta for selada com a pipeta no terminal sináptico, nenhuma corrente de cálcio discernível será observada devido às grandes correntes de vazamento provocadas pelo acoplamento por junções comunicantes nos processos laterais das células bipolares MB. O que se observa é uma grande corrente de vazamento semelhante a uma corrente para fora.

No entanto, ainda é possível monitorar o salto de capacitância com um estímulo senoidal de alta frequência ativado antes e depois do passo despolarizante mostrado. Abaixo estão exemplos de I-R-D-I-C, imagens de terminais de células bipolares M. Os terminais intactos tendem a apresentar-se mais elípticos, como mostrado em A e B, enquanto C mostra o terminal misto, que aparece redondo e circular.

O método de preenchimento com corante também pode ser utilizado para classificar os terminais celulares. Abaixo estão exemplos de imagens de fluorescência dos terminais de células bipolares MBI com um axônio intacto em D, um axônio parcialmente cortado em E e um axônio completamente removido em F. Seus terminais são indicados pelas setas azuis. Aqui são mostradas as medições diretas dos sinais de imagem de cálcio, exocitose e feedback inibitório.

Em um terminal de célula bipolar MB, uma concentração transitória crescente de cálcio nas telerias de um terminal MB foi ativada por uma despolarização em degrau com clamp de tensão, na qual a imagem de fluorescência correspondente das telerias MB pode ser observada em B. Exemplos de depressão sináptica de curto prazo na liberação de neurotransmissores são mostrados em C. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de minimizar a quantidade de solução ao redor da retina ao colocá-la no bloco de ágar. Isso melhorará a adesão da estrutura à base do bloco de ágar.