Electroeluting fragmentos de DNA

Olá. Hoje vamos mostrar como a eletroeluição é realizada para purificar fragmentos de DNA, como produtos de digestão e PCR. Para finalidades posteriores, como clonagem e sequenciamento, a eletroeluição pode ser um dos métodos de escolha. Com base na carga elétrica negativa do DNA, uma barreira celular alta é colocada dentro do campo elétrico, retendo os fragmentos e impedindo sua migração adicional.

Este método permite a purificação de uma ampla variedade de tamanhos de fragmentos de DNA provenientes de diferentes fontes, com uma eficiência relativamente alta de até 80%. Seu baixo custo representa outra vantagem da eletroeluição quando comparada a outros métodos de purificação, como colunas, kits com resina, entre outros. A amostra de DNA é inicialmente visualizada por eletroforese em gel de agarose corado com brometo de etídio, a fim de visualizar e identificar o fragmento desejado a ser purificado, devendo a eletroforese prosseguir.

Quando os fragmentos estão bem separados, os de tamanho inferior podem ser precisamente determinados. Após a eletroforese, o fragmento desejado é cuidadosamente excisado do gel usando uma lâmina de barbear nova e tomando o cuidado de cortar a fatia de gel o mais próximo possível da faixa de interesse.

Este procedimento deve ser realizado com proteção adequada contra a luz UV e usando luvas. Após encher o eletrolisador com o tampão de eletroforese apropriado e tomar cuidado para derramá-lo sobre a superfície da plataforma central, o fragmento de gel é colocado dentro de uma das rodas o mais próximo possível do canal em V. Não deve haver bolhas dentro do canal em V.

Isso pode ser evitado lavando o canal com tampão para remover qualquer ar aprisionado. Em seguida, 100 microlitros da barreira de alta salinidade são adicionados cuidadosamente ao canal V a partir do local próximo ao poço. A câmara é fechada e os eletrodos são conectados à fonte de energia para iniciar a eletrolise em 100 a 120 volts.

O intervalo de tempo dependerá do tamanho do fragmento para fragmentos grandes de até 20 kbs. De 50 minutos a uma hora deve ser suficiente, e fragmentos pequenos devem ser monitorados a cada 10 minutos com luz UV para evitar maior eluição através da solução salina e para dentro da cadeia de tampão final. Neste caso, digerimos 560 nanogramas de plasmídeo com as enzimas ND uma e entry para liberar um fragmento de 900 pares de bases, equivalente a 84 nanogramas de uma amostra.

Assim, após colocar o fragmento de gel na cavidade, a eletroeluição prosseguirá por 25 minutos a 100 volts. Uma vez concluída a eletroeluição e os fragmentos de DNA retidos no tampão sul na região do canal em V, recuperam-se 400 microlitros de solução do canal, do lado distal do recipiente, e transfere-se para um microtubo de 1,5 microlitro utilizando uma ponteira fina acoplada a uma micropipeta. Prossiga então para a precipitação alcoólica, adicionando dois volumes de etanol absoluto gelado e misturando em vórtex. Adicionalmente, podem-se adicionar dois a três microlitros de glicogênio para melhorar o rendimento da recuperação de DNA. Incube os tubos clássicos a menos 20 graus Celsius por uma hora ou, alternativamente, armazene nesta temperatura durante a noite. Em seguida, centrifugue a quatro graus Celsius na velocidade máxima por 25 minutos.

Este sobrenadante cardíaco e lavagem adicionando um mililitro de etanol gelado a 70%. Centrifugue a quatro graus Celsius em velocidade máxima por cinco a 10 minutos, descarte o sobrenadante e deixe secar à temperatura ambiente com os tubos em posição invertida, ressuspenda o precipitado em 10 a 15 microlitros de água livre de nucleases e prossiga para determinar a concentração da amostra. Neste caso, a amostra purificada foi ressuspendida em 10 microlitros de água e quantificada em um espectrofotômetro no comprimento de onda de 260 nanômetros, mostrando uma concentração de 6,3 nanogramas por microlitro, o que representa uma eficiência de 75%. Você pode estar pensando que seria melhor investir apenas 10 minutos do seu precioso tempo com um kit.

No entanto, apesar do tempo consumido neste processo, você será capaz de controlar muitas das variáveis que permitirão purificar uma ampla gama de amostras com diferentes tamanhos e origens naturais. Como você pode ter observado no presente caso, uma eficiência de 75% foi observada, igual ou superior à maioria dos kits de purificação de DNA. Obrigado por se juntar a nós hoje.

Esperamos que você tenha encontrado este protocolo útil para seus projetos de pesquisa.