Detecção de bactérias utilizando DNAzymes fluorogénicas

O objetivo geral do experimento a seguir é detectar rapidamente a presença de bactérias específicas, como *E. coli*, utilizando sondas de DNA fluogênicas Zyme inovadoras. Primeiro, sondas de DNA genic completo Zyme são geradas por ligação. Em seguida, as bactérias são cultivadas para enriquecer o número de moléculas-alvo e uma mistura extracelular acumulada é preparada a partir do sobrenadante.

A mistura extracelular bruta é então combinada com a sonda DNAzima; a interação entre a sonda DNAzima e as moléculas-alvo resulta na clivagem da sonda, que passa a fluorescer. A interação entre a sonda e o alvo é detectada por meio de um fluorímetro, observando-se um aumento na fluorescência relativa. Os resultados são então verificados utilizando análise por eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos baseados em PCR ou em anticorpos é que o procedimento é mais simples e fácil de realizar. Embora este método tenha sido desenvolvido com a bactéria modelo Escherichia coli, ele pode ser aplicado na detecção de qualquer outro patógeno bacteriano transmitido por alimentos ou hospitalar. Geralmente, indivíduos novos nesta técnica podem ter dificuldades, pois podem não estar acostumados ao manuseio de sondas de DNA sintéticas e de bactérias. A demonstração do procedimento é feita por Sergio Aguire, assistente de pesquisa do meu laboratório, e Monso Ali, pesquisador pós-doutorando, para este protocolo.

R-F-D-E-C um é o DNAzyme em destaque. Ele consiste na sequência catalítica EC um, sublinhada em preto, e na sequência do substrato FS um, sublinhada em verde; contida dentro do substrato, há uma ligação de RNA indicada pelo r azul, flanqueada por um DT marcado com fluoróforo indicado pelo F e por um DT marcado com quencher indicado pela letra Q. RF SS um é uma versão embaralhada do R-F-D-E-C um, na qual a sequência catalítica EC um é parcialmente reorganizada em SS um, mas a porção FS um permanece inalterada. RF DEC um e RF SS um são produzidos por ligação enzimática mediada por molde, ligando o oligonucleotídeo FS um ao oligonucleotídeo EC um ou SS um, na presença de LT um como molde de ligação, para preparar misturas extracelulares brutas, ou cems, que serão usadas como alvo para R-F-D-E-C um. Comece dispensando dois mililitros de LB em tubos de cultura estéreis de 14 mililitros utilizando uma pipeta automática.

Em seguida, utilizando uma ponteira estéril, retire uma única colônia de E. coli de uma placa de ágar e coloque-a em um tubo de cultura contendo LB. Coloque os tubos em um incubador ajustado a 37 graus Celsius e agite a 250 rpm por 14 horas após a incubação. Para gerar um cultivo de re-inoculação a 1%, distribua dois mililitros de LB fresco em tubos de cultura de 14 mililitros e adicione 20 microlitros do cultivo bacteriano do passo anterior.

Incube os tubos a 37 graus Celsius com agitação a 250 RPM até que cada solução bacteriana atinja uma DO 600 de aproximadamente um. Transfira um mililitro de cada cultura para um novo tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro e pelote as células por centrifugação a 11.000 ×g durante cinco minutos. Após a centrifugação, transfira o sobrenadante límpido para um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro novo.

Armazene o sobrenadante a menos 20 graus Celsius. Se ele não for usado imediatamente para determinar se um sinal fluorescente é gerado com a interação das enzimas de DNA com o extrato celular bruto, as amostras são analisadas por espectrofotometria. Ligue o espectrofotômetro de fluorescência e configure os parâmetros de aquisição de dados com excitação em 488 nanômetros e emissão em 520 nanômetros.

Configure também o instrumento para realizar leituras a cada minuto durante uma hora. Lave três cubetas de cristal de quartzo primeiro com água desionizada destilada e, em seguida, com etanol a 100%. Seque as cubetas passando gás nitrogênio.

Rotule as cubetas como C um para controle um, C dois para controle dois e T para teste. Em seguida, transfira 24 microlitros de água destilada e desionizada para C um e 24 microlitros da mistura extracelular bruta de e coli preparada para C dois e T. Adicione 25 microlitros de dois X RB a cada cubeta e coloque-as no espectrofotômetro de fluorescência. Inicie a coleta de dados de fluorescência após cinco minutos, adicionando um microlitro de RFS S um a cinco micromolar a C dois e um microlitro de RFD eec um a cinco micromolar a T e C um, garantindo que as leituras de fluorescência não sejam interrompidas. Misture cada solução por pipetagem, então permita que a reação prossiga pelo restante do período de aquisição.

Salve os dados no formato de arquivo do Excel. Em seguida, transfira os dados para um computador pessoal e use o Excel para criar uma imagem gráfica. As mesmas misturas de reação que foram utilizadas para análise por espectroscopia.

A fotometria pode ser utilizada para análise por eletroforese em gel. Após uma hora de aquisição, remova as cubetas do espectrofotômetro e transfira as soluções para novos tubos de microcentrífuga.

Interrompa as reações adicionando cinco microlitros de acetato de sódio 3 molar e 125 microlitros de etanol a 100%. Misture cada solução por vortex e coloque os tubos no congelador a menos 20 graus Celsius por uma hora após a centrifugação de incubação. Centrifugue as misturas reacionais a 11.000 ×g durante 20 minutos a quatro graus Celsius e remova cuidadosamente o sobrenadante por pipetagem.

Seque os pellets usando um concentrador de DNA por 10 minutos. Adicione 20 microlitros de tampão de carga para gel e vortex brevemente. Centrifugue brevemente com uma centrífuga de bancada.

A seguir, carregue 10 microlitros das amostras da reação por poço em gel de Dage 10% após a eletroforese. Remova as placas de vidro e lave-as cuidadosamente com água da torneira. Para remover quaisquer resíduos de gel, limpe as placas com um lenço de papel Kim.

Analise a placa de gel por fluorescência utilizando um scanner typhoon. Analise as imagens resultantes usando software de quantificação de imagens para avaliar a sensibilidade do sistema. Culturas diluídas em série são cultivadas por períodos de tempo crescentes.

Para determinar o período mínimo de incubação necessário para detectar uma única bactéria, prepare 10 tubos de cultura contendo dois mililitros de LB, inocule cada cultura com 100 microlitros de dois UFC por mililitro de um estoque glicerolado de E. coli e incube a 37 graus Celsius com agitação a 250 RPM nos tempos de 4, 8, 12, 16 e 24 horas. Recolha 300 microlitros de cada um dos tubos de cultura inoculados, já que pode não haver bactérias detectáveis nas amostras colhidas nos momentos de 4, 8 e 12 horas.

Deixe a cultura restante crescer por 24 horas para identificar culturas contendo bactérias. Meça a DO600 e precipite as células por centrifugação a 11.000 G durante cinco minutos. Transfira o sobrenadante, que contém os CEMS, para tubos microcentrífugos novos de 1,5 mililitro e armazene a menos 20 graus Celsius até o uso no dia seguinte.

Inspecione as culturas quanto ao crescimento. Apenas uma ou duas das 10 culturas podem conter *E. coli* após a inoculação, e os tubos restantes não conterão nenhuma célula. Utilize os CEMS recuperados das culturas positivas nos pontos de tempo designados para preparar reações de clivagem com RFD EEC um, analise as misturas de reação utilizando eletroforese em gel DAGE conforme descrito anteriormente, ambas as sondas RFD EEC um e RF SS um foram preparadas por ligação enzimática das porções de DNAzima ao substrato.

A interação entre CEM EEC e RFD EEC um ou RF SS um foi então avaliada por espectrometria. Como pode ser visto aqui, R-F-D-E-C um produziu um alto nível de sinal fluorescente após a adição de CEM ec.

Em acentuado contraste, R FS S um não produziu um sinal fluorescente forte. Assim, a função de produção de fluorescência de RFD EEC um. Após o contato com CEM EC, é sequenciado.

Específico para verificar se os aumentos observados na fluorescência foram devidos à clivagem da ligação de RNA. As misturas de reação foram analisadas por clivagem em dage de RFD eec, uma por hidróxido de sódio 0,25 molar, espera-se que gere fragmentos de ácido nucleico 2D, um fragmento em cinco primos retendo o Fluor e um fragmento em três primos retendo o quencher. Como pode ser visto aqui.

A mistura de reação RFD EEC CEM EEC realmente produziu o produto de clivagem esperado. Além disso, apenas a UNC clivou R-F-D-E-C um, e o fragmento da extremidade cinco-prime pôde ser detectado por imagem de fluorescência. Para examinar a especificidade de RFD EEC um, ensaios de fluorescência foram realizados utilizando CEMS coletados apenas de várias outras bactérias gram-negativas e gram-positivas.

A amostra contendo CEM EC produziu um aumento na fluorescência. A ausência de reatividade cruzada com CEMS de outras bactérias indica que o R-F-D-E-C um é altamente seletivo para e coli para determinar o tempo mínimo de cultura necessário para detectar uma única célula de e coli. e coli diluído para uma UFC por mililitro em 100 microlitros foi cultivado com meio de crescimento por 4, 8, 12, 16 e 24 horas. Os CEMS resultantes foram misturados com R-F-D-E-C um e a clivagem foi avaliada por dage, conforme mostrado aqui.

Uma imagem do ensaio Dage indica que R-F-D-E-C não produziu o produto de clivagem esperado. Quando reagido com CEM, o ECS coletado aos quatro e oito horas de crescimento indica que um tempo de cultivo de 12 horas é necessário uma vez dominado.

O componente-chave dessa técnica é que o ensaio baseado em enzima DA pode ser realizado em 60 minutos, se for executado corretamente após este desenvolvimento. O procedimento abriu caminho para que pesquisadores na área de bioanálise explorassem enzimas de DNA alogênicas para a detecção de uma ampla gama de patógenos bacterianos.