Microscopia intravital da Microcirculação cérebro de camundongo usando uma janela fechada Cranial

O objetivo geral deste procedimento é estudar a microcirculação no cérebro de camundongos por microscopia intravital, técnica que permite acompanhar alterações dinâmicas nos marcadores hemodinâmicos e inflamatórios na microcirculação pial ao longo de períodos prolongados de tempo. Esta técnica foi desenvolvida no Instituto de Bioengenharia de La Jolla, onde foi utilizada em diversos tipos de estudos. Por exemplo, no acompanhamento de alterações hemodinâmicas durante o curso da infecção por plasmodium berghei e no momento da expressão da malária cerebral.

Isso é realizado primeiramente implantando uma janela craniana crônica duas semanas antes dos estudos de microscopia intravital. O segundo passo do procedimento consiste em registrar a morfologia geral da janela craniana utilizando uma imagem digital de alta resolução em baixa ampliação. O terceiro passo do procedimento é adquirir imagens de microscopia intravital utilizando iluminação convencional e fluorescente, e selecionar locais específicos de estudo para medições em tempo real do diâmetro dos vasos e da velocidade das hemácias.

O passo final do procedimento é realizar a análise intravital da aderência de leucócitos e plaquetas nos vasos pilares por meio de anticorpos específicos marcados com fluorescência. Em última instância, podem-se obter resultados que demonstram, in vivo, alterações microcirculatórias em modelos cerebrais que refletem condições fisiológicas, fisiopatológicas ou patológicas, por meio da microscopia intravital cerebral, permitindo estabelecer as alterações hemodinâmicas associadas a essas condições. A principal vantagem dessa técnica é que observamos o cérebro em seu ambiente fisiológico, sem expô-lo a agentes externos ou meios artificiais; em comparação com a ressonância magnética e a angiografia por imagem, a microscopia intravital possui resoluções espacial e temporal superiores e nos permite observar desde o nível macroscópico até o nível microscópico.

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na fisiologia e na fisiopatologia da microcirculação cerebral, como alterações hemodinâmicas e inflamatórias durante doenças agudas e crônicas. De duas a três semanas antes da microscopia intravital, realiza-se uma craniotomia em camundongos com idade entre oito e dez semanas, conforme previamente demonstrado, exceto pelo fato de que uma barra de titânio não é colocada na cabeça do animal. A janela craniana crônica é uma preparação estável, permitindo a análise da microcirculação pial mesmo meses após sua implantação, no dia do experimento.

Primeiro, verifique a temperatura corporal do animal antes de colocá-lo em um estereotáxico, infundindo previamente eritrócitos marcados com fluorescência através da veia da cauda do camundongo. Isso permitirá o rastreamento dos eritrócitos, o que será demonstrado posteriormente. Em seguida, anestesie levemente o camundongo com isoflurano.

4% para indução, um a 2% para manutenção. Em seguida, posicione o animal em decúbito ventral em um estereotáxico sobre uma placa aquecida. Fixe a cabeça cuidadosamente usando as barras auriculares e ajuste o nível utilizando as alavancas direita e esquerda.

Limpe suavemente a lamínula na janela craniana com um cotonete umedecido com óleo mineral. Em seguida, utilizando um microscópio estereoscópico conectado a uma câmera digital, tire algumas fotografias panorâmicas dos vasos sob a janela. Após transferir as fotos panorâmicas para um computador, selecione a melhor delas para ser impressa, identificada e datada.

Esta foto será usada como um mapa para medições do diâmetro do vaso e das velocidades das hemácias, o que será demonstrado a seguir para iniciar a microscopia intravital. Transfira o camundongo para uma plataforma de microscópio intravital personalizada. Coloque uma gota de água sobre a janela craniana, aproveitando o reservatório formado pelo acrílico dental.

Utiliza-se uma objetiva de imersão em água 20x com abertura numérica de 0,5. As imagens são registradas usando duas câmeras: uma câmera digital de baixa luminosidade e alta velocidade conectada a um computador e monitor, e uma câmera analógica de baixa luminosidade conectada a uma fita VCR, um carimbo de data/hora e um monitor colorido. Antes de selecionar os vasos para medição, verifique os vasos para avaliar a qualidade do preparo e se o sangue está fluindo em todos os vasos; em seguida, selecione os vasos a serem medidos. Eles devem incluir vênulas e arteríolas de diferentes diâmetros e cobrir diferentes localizações dentro da área exposta pela janela.

No nosso experimento, selecionamos 12 vasos para medição ao observar diversos campos dentro da janela craniana. Para selecionar os vasos, anote a localização precisa de cada ponto a ser medido na foto da vasculatura PY que foi tirada anteriormente; para cada ponto, o diâmetro do vaso é medido utilizando um dispositivo de cisalhamento de imagem. Uma vez que o ponto é selecionado, a imagem do vaso é alinhada na posição vertical e a imagem é cisalhada até as bordas opostas.

Os extremos são alinhados e a leitura é documentada. Para o rastreamento de eritrócitos, cada ponto é registrado pela câmera digital por pelo menos 30 segundos, e as imagens de vídeo são gravadas a 150 quadros por segundo. Essa taxa é definida para obter de uma a seis imagens de uma célula em um único quadro de vídeo, para a determinação de velocidades de até seis milímetros por segundo.

Após a conclusão da coleta de dados, remova o camundongo do estereotáxico e retorne-o à sua gaiola para se recuperar da anestesia usando o software apropriado. As imagens de vídeo adquiridas são digitalizadas e os dados de coordenadas XY para cada imagem de célula são obtidos. As posições das células são determinadas manualmente, em vez de por análise de imagem.

Considerando que o olho de um observador treinado fornece uma boa estimativa da localização do centro de uma célula, o que em geral corresponde ao local de fluorescência máxima observada. Para a maioria das orientações celulares, as determinações de posição e velocidade são realizadas em 15 células em cada vaso. Uma média é calculada para obter a velocidade média das hemácias, uma vez disponíveis as medidas do diâmetro do vaso e da velocidade das hemácias.

O cálculo do fluxo sanguíneo em cada vaso pode ser feito utilizando a fórmula Q igual a D sobre dois elevado ao quadrado vezes PI vezes V, onde Q equivale ao fluxo sanguíneo, V equivale à velocidade das hemácias e D equivale ao diâmetro do vaso, para avaliação da perfusão e análise da aderência de leucócitos em vasos capilares. A microscopia intravital é realizada em um animal infundido com uma mistura de albúmina marcada com FSE e anticorpos contra o marcador pan-leucocitário CD45 marcado com Texas Red. A albúmina marcada com fluorescência permite uma melhor visualização da rede vascular, incluindo vasos penetrantes, e é particularmente útil em estados patológicos, como malária cerebral, para verificar a presença de vasos não perfundidos ou subperfundidos.

Os anticorpos anti-CD45 marcados com fluorescência facilitam a identificação e a quantificação da rolagem e adesão de leucócitos aos vasos post-capilares. A quantificação da adesão de leucócitos é realizada contando o número de leucócitos em um segmento vascular de 100 mícrons de comprimento. A rolagem é quantificada contando o número de leucócitos que se deslocam com velocidade significativamente menor que a velocidade sanguínea no mesmo segmento de 100 mícrons durante 30 segundos. Mostrado.

Aqui está um exemplo de medições da velocidade de hemácias na microcirculação por rastreamento celular a partir de fluorescência de alta velocidade. As gravações de vídeo das imagens A a F são sequências da microcirculação. Cada imagem representa a posição de uma única hemácia em movimento, capturada quadro a quadro por uma câmera de alta velocidade.

Este gráfico de um experimento representativo mostra as alterações no fluxo sanguíneo do baço ao longo do tempo. Em camundongos infectados com plasmodium, burgi, onca e em camundongos controle não infectados, enquanto nos camundongos controle, o fluxo sanguíneo do baço é relativamente estável ao longo do tempo. Camundongos infectados com PBA apresentam uma acentuada diminuição no fluxo sanguíneo no momento do desenvolvimento da malária cerebral.

No sexto dia, a coloração com anticorpos fluorescentes anti-CD45 marcados com vermelho Texas revela um grande número de leucócitos aderidos aos vasos sanguíneos de um camundongo infectado com Plasmodium berghei. Este procedimento possui uma ampla gama de aplicações além daquela demonstrada aqui hoje. Qualquer técnica óptica que possa ser utilizada in vivo pode ser adaptada a este modelo, e parâmetros como tecido, nível de oxigênio no tecido, pH, espécies reativas de oxigênio e interação endotelial com leucócitos podem ser estudados neste modelo.