Um método para 2-Photon Imagens de Fluxo de Sangue no neocórtex através de uma janela Cranial

A capacidade de imaginar a vasculatura cerebral e registrar a dinâmica do fluxo sanguíneo no cérebro intacto de roedores vivos é uma técnica poderosa que pode ser aplicada ao estudo da isquemia cerebral ou da fisiologia normal do cérebro. Aqui demonstraremos como usar dois microscópios fotônicos para imaginar a dinâmica do fluxo sanguíneo no neocórtex de camundongos vivos, utilizando corantes fluorescentes injetados na veia da cauda. Esta técnica foi originalmente desenvolvida por David Kleinfeld em Winfred Dank.

Olá, sou Ricardo Mota do Laboratório de Carlos Porter Cayo, do Departamento de Neurologia da Universidade da Califórnia em Los Angeles. Em um vídeo anterior, mostramos a vocês o método para implantar uma janela craniana para experimentos crônicos de imagem in vivo. Hoje vamos mostrar o procedimento para imagens da dinâmica do fluxo sanguíneo na córtex cerebral por meio de uma janela craniana.

Este preparo é muito útil porque permite imaginar profundamente dentro do cérebro utilizando microscopia a laser de dois fótons. Então vamos começar. Para imaginar a vasculatura cerebral, os animais devem ser injetados intravenosamente com um corante fluorescente.

Utilizamos corantes conjugados com dextrano porque o grupo dextrano impede que o corante atravesse a barreira hematoencefálica e vaze para fora dos vasos sanguíneos. Os camundongos são anestesiados com isoflurano, 4% para indução e 1,5 a 2% durante a injeção. Em seguida, a cauda é desinfetada com três passes de álcool 70%; com uma agulha de calibre 26, injeta-se de 75 a cem microlitros de uma solução a 5% de dextrano de R domina dissolvida em soro fisiológico pela veia da cauda.

No ponto médio do eixo da cauda, os animais podem ser imediatamente submetidos à imagem após a injeção na veia da cauda, até que o corante seja excretado na urina, a qual ficará rosa se for utilizado o corante ERO domine. Cerca de duas horas após a injeção do corante fluorescente Dexter, o camundongo é anestesiado com isoflurano: novamente, 4% para indução e 1 a 1,5% para a aquisição de imagens. O camundongo é firmemente fixado, por meio de uma barra de titânio, à platina do microscópio, que contém um tapete aquecedor com regulação térmica para manter o animal aquecido.

É aplicado um pouco de pomada ocular para manter os olhos úmidos. A lamínula da janela craniana é limpa com álcool a 70%. A janela é posicionada paralelamente ao plano focal e centralizada no campo de visão.

Sob a objetiva de 4x, é melhor tirar uma fotografia dos vasos da superfície cerebral com uma câmera digital. Esta imagem será usada como referência nas sessões de imagem subsequentes para localizar repetidamente a região de interesse dia após dia. Em seguida, a objetiva de 4x é substituída por uma objetiva de imersão em água de 40x.

Sem mover o estágio, é tirada a imagem digital da vista. Novamente, as coordenadas do manipulador do estágio são ajustadas em zero. Utilizamos o Scan Image como o software de aquisição de imagens.

Isto foi escrito em MATLAB por Tom Paul Rudo e Bernardo Sabatini no laboratório de Carls Voto. Em seguida, ligamos todos os outros equipamentos, o laser, o medidor de potência, os tubos fotomultiplicadores, os amplificadores, entre outros. A área da janela adequada para ser imageada é escaneada brevemente em baixa ampliação para encontrar as melhores regiões.

Uma vez identificadas, é feita uma pilha de baixa ampliação da região escolhida para imagem e suas coordenadas XY são anotadas para registrar a dinâmica do fluxo sanguíneo em vasos pequenos ou capilares. Utilizamos varreduras em linha ao longo de pelo menos 40 mícrons do vaso de interesse. Essas varreduras únicas, com duração de um segundo, são realizadas usando a menor potência de laser possível, e as coordenadas e o ângulo de varredura são anotados.

Após o término da sessão de imagem, o animal é transferido para uma câmara aquecida onde pode se recuperar da anestesia. Aqui mostramos uma pilha de cem imagens obtidas a cada cinco mícrons com nosso microscópio de dois fótons através de uma janela craniana posicionada sobre o córtex somatossensorial de um camundongo de cinco meses de idade que foi injetado com dextrano r Domine através da veia caudal. Esta sequência de imagens mostra a rede complexa de vasos sanguíneos grandes e pequenos, incluindo capilares.

Acabamos de mostrar um método para a visualização da dinâmica do fluxo sanguíneo in vivo por meio de uma janela craniana. Este é um método extremamente poderoso para imagens da dinâmica do fluxo sanguíneo cerebral na vasculatura cortical, por exemplo, para investigar alterações no fluxo sanguíneo após um acidente vascular cerebral. Múltiplas aquisições de imagens podem ser realizadas em diferentes momentos em BULs por meio de injeções repetidas na veia caudal do corante fluorescente.

Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de trabalhar nas condições mais limpas e estéreis possíveis e ter uma mão muito firme. Pronto, é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.