Determinação do Número celular durante Cultura Celular usando o contador de células Scepter

O contador de células Scepter é um dispositivo automatizado portátil para contagem de células, monitoramento do diâmetro e volume celular e verificação da saúde e qualidade das populações celulares. Oferece vantagens significativas em comparação com outros métodos de contagem, incluindo maior precisão, facilidade de uso e baixo custo para contagem de células. Utilizando o Scepter, siga as instruções exibidas em sua tela gráfica para aspirar as células para dentro do sensor descartável.

As células são então contadas e o dispositivo fornece as concentrações celulares e estatísticas, que podem ser enviadas para um computador e analisadas. Olá, eu sou a Sonya. Sou cientista pesquisadora aqui na Millport e hoje vou mostrar a vocês como usar o scepter.

O contagem de células é uma etapa necessária, mas tediosa, no cultivo celular in vitro. Concentrações celulares consistentes garantem reprodutibilidade e precisão experimentais. A contagem de células é importante para monitorar a saúde celular e a taxa de proliferação, avaliar o plaqueamento de células imortais ou transformadas para experimentos subsequentes, transfeção ou infecção, e preparar ensaios baseados em células, apesar da necessidade de velocidade e precisão.

No contagem celular, 71% dos 400 pesquisadores pesquisados realizam a contagem de células utilizando um hemocitômetro. Embora a hemocitometria seja econômica, ela é trabalhosa e está sujeita a viés e uso incorreto por parte do operador, o que resulta em contagens imprecisas. As fontes de erro na hemocitometria incluem distribuição desigual das células na amostra, bem como número excessivo ou insuficiente de células na amostra.

Decisões subjetivas quanto a se uma determinada célula está dentro da área definida para contagem. Contaminação do hemocitômetro, variação entre usuários e variação na taxa de preenchimento do hemocitômetro para aliviar a tediosidade associada à contagem manual. 29% dos pesquisadores contam células utilizando dispositivos automatizados de contagem celular.

No entanto, para a maioria dos pesquisadores, o preço associado a esses grandes instrumentos de bancada representa uma barreira para o seu uso. O contador de células Scepter é um dispositivo automático portátil que oferece a automação e a precisão da contagem Coulter a um custo relativamente baixo, em um formato fácil de usar e manual. O sistema utiliza o princípio Coulter de detecção de partículas por impedância em um formato miniaturizado, empregando uma combinação de hardware analógico e digital para processamento de sinal sensorial, armazenamento de dados e exibição gráfica.

O sensor descartável é projetado com uma zona de detecção celular microfabricada que permite discriminação por tamanho e volume celular com resolução submicrométrica e subpicolitro, aprimorada por canais de manipulação precisa de líquidos e eletrônica. O contador de células Scepter exibe graficamente as estatísticas da população celular como um histograma para utilização. O contador de células Scepter inicia-se pela diluição de uma suspensão simples de células em solução salina tamponada com fosfato.

Uma concentração de 10.000 a 500.000 células por mililitro é ideal. Transfira 100 microlitros de células diluídas para um tubo microview de 1,5 mililitro. Ligue o contador de células Scepter pressionando e segurando o botão na parte traseira do instrumento e aguarde até que as instruções na tela apareçam.

Quando solicitado, fixe um sensor na extremidade da unidade do cetro com o painel sensor de eletrodo voltado para a frente do instrumento. Os sensores Scepter são compostos por uma câmara de amostragem moldada com precisão, com uma zona sensora eletrônica e eletrodos sensores de células integrados. Os sensores permitem discriminar o tamanho celular com resolução submicrométrica e o volume celular com resolução subpicolitro.

A engenharia consistente do sensor garante que volumes iguais de amostra sejam contados e que medidas precisas de tamanho sejam realizadas. Uma vez que o sensor estiver acoplado, realize cada etapa do processo de contagem de acordo com as instruções exibidas na tela conforme a seguir. Quando a tela indicar, pressione e mantenha pressionado o êmbolo para começar a pressionar o êmbolo; a tela então exibirá "mergulhe o sensor", mergulhe o sensor na solução de suspensão celular e solte o êmbolo para aspirar a suspensão celular para dentro do sensor.

O êmbolo atua como um sinal elétrico e irá aspirar a amostra juntamente com o volume morto para dentro do sensor. A velocidade ou precisão do movimento do êmbolo não é relevante, diferentemente do que ocorre com a pipetagem. Esse processo levará vários segundos até estar pronto.

O instrumento emitirá um sinal sonoro e a amostra carregada será exibida na tela. Uma vez que a amostra é carregada no sensor, ela é aspirada através da zona de detecção para avaliar o tamanho e o volume celular. Em seguida, através dos microcanais, quando 50 microlitros da amostra forem contados, o sensor informa ao instrumento para interromper a contagem.

Após a contagem ser concluída, a tela do instrumento exibirá "contagem concluída". Remova o sensor e descarte-o. Siga a instrução e remova e descarte o sensor.

O instrumento exibirá então um histograma do tamanho ou diâmetro celular em sua tela, bem como a concentração de células por mililitro. Após a contagem ser concluída e o histograma ser exibido no instrumento, aplique as portas pressionando o botão de alternância, selecione o dimensionamento automático ou use a última opção para definir automaticamente a porta com base no perfil do histograma ou para utilizar as portas da contagem anterior. Independentemente da seleção, as portas podem ser movidas manualmente para ajuste fino.

Ajuste os dados, pressione o botão de alternância novamente para selecionar o portão esquerdo e role o controle para mover o portão conforme desejado. Em seguida, pressione o botão de alternância novamente para ativar o portão direito e role o controle para posicionar o portão direito. Clique novamente.

Uma nova concentração celular, volume celular médio e diâmetro serão exibidos. O botão alternador também pode ser movido para qualquer lado para alternar a exibição entre data e hora, tamanho médio de célula e volume celular médio; até 72 histogramas podem ser armazenados no próprio instrumento. Para carregar os dados em um computador pessoal, conecte o instrumento por meio da porta do cabo USB, na tela de exibição do computador.

Dê um duplo clique no aplicativo de software scepter para iniciar o software. Em seguida, clique em conectar. Todas as contagens serão transferidas automaticamente para o software.

O software de aplicação scepter exibe o histograma com detalhes sobre a distribuição populacional da cultura em volume ou diâmetro. Os arquivos baixados podem então ser exportados para o Microsoft Excel, onde os dados brutos serão exibidos em intervalos de diâmetros celulares ou volumes celulares especificados. Dezenove linhagens celulares diferentes foram preparadas para contagem e as concentrações iniciais teóricas foram determinadas usando o contador aculter.

Essas suspensões celulares foram então diluídas adicionalmente para obter suspensões celulares com concentrações celulares teóricas. O contador de células Scepter foi então utilizado para determinar as concentrações celulares. Esta figura mostra cinco diluições que foram medidas para cinco linhagens celulares representativas juntamente com a concentração celular teórica.

O alto grau de linearidade, indicado pelos valores de r-quadrado, demonstra que a contagem com o scepter é um método confiável para as linhagens celulares testadas em uma ampla faixa linear de operação. A precisão relativa geral da contagem com o scepter é demonstrada aqui, na qual os dados obtidos por meio da contagem com o scepter são comparados com as contagens obtidas pela contagem com o coter. O logaritmo das contagens celulares com o scepter é representado graficamente em função do logaritmo das contagens com o coter e mostra que, em todas as linhagens celulares testadas, as contagens com o scepter correspondem às contagens com o coter.

As contagens de 19 linhagens celulares foram realizadas utilizando um contador Coulter Z two. O contador celular Scepter, um contador automatizado baseado em visão, como o sistema V cell ou count test, e as contagens de hemo TER foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante, utilizando a mesma suspensão inicial de células e diluições idênticas. Os resultados apresentados nesta figura demonstram que as concentrações celulares medidas pelo método de contagem com Scepter correspondem de perto às concentrações celulares teóricas, com alta linearidade.

O coeficiente percentual de variação ou CV foi calculado para cada diluição de cada linhagem celular. Para cada sistema de contagem apresentado, são mostrados os CVs percentuais médios ao longo de 19 linhagens celulares em relação à concentração celular e ao método de contagem dentro da faixa de operação. O contador de células Scepter é mais preciso do que a contagem com hemocitômetro, apresentando desvios-padrão menores e coeficientes médios de variação menores.

A contagem com o Scepter é 10 vezes mais rápida do que a hemocitometria e também mais rápida do que outros contadores automatizados. Aqui, as células SF nine, MCF seven e HC 2 93 foram contadas utilizando os métodos descritos neste vídeo. O tempo médio necessário para medir a concentração celular foi registrado.

Observe que a hemocitometria foi realizada apenas uma vez por amostra. O Scepter realiza medições com base no tamanho celular. Assim, quaisquer alterações na morfologia celular podem ser capturadas no histograma.

Culturas saudáveis exibem uma boa distribuição gaussiana em forma de sino, enquanto células não saudáveis morrem e causam um deslocamento do histograma para a esquerda. Da mesma forma, quando uma população de 50% de células mortas foi misturada com 50% de células vivas, também foram observados deslocamentos no histograma. Acabei de mostrar como usar o novo contador de células Scepter da Millipore, que está revolucionando a maneira como os pesquisadores contam suas células.